Single Cell Cytometry of Mouse Brain Tissue

뇌는 수십억 개의 세포가 지방질 절연체로 둘러싸여 있고 복잡한 구조 단백질의 그물망에 의해 지지되며 서로 빽빽하게 붙어 있는 조밀하고 복잡한 네트워크입니다. 이 세포들을 개별적으로 연구하기 위해 과학자들은 먼저 이 끈적한 기질로부터 세포들을 분리하여, 고체 조직을 단일 세포의 자유로운 액체 상태로 만들어야 합니다. '해리(dissociation)'라고 알려진 이 과정은 뇌의 세포들이 매우 단단히 결합되어 있고 취약하기 때문에 까다롭기로 악명이 높습니다. 너무 강하게 잡아당기면 세포가 죽거나 연구자가 관찰하고자 하는 바로 그 특징들을 잃어버릴 수 있기 때문입니다. 수십 년 동안 과학자들은 내부의 섬세한 세포들을 파괴하지 않으면서 조직을 분해하는 방법을 찾기 위해 애써왔으며, 이러한 과제는 건강과 질병 상태에서 뇌의 다양한 뉴런과 면역 세포들이 어떻게 기능하는지를 이해하는 데 한계로 작고 있었습니다.

콜로라도 안슈츠 의과대학의 연구팀은 이제 이 어려움을 극복할 수 있는 신뢰할 만한 경로를 밝혀냈습니다. 그들은 성체 마우스 뇌 조직을 단일 세포 현탁액으로 만드는 다양한 방법들을 테스트하며, 단순한 기계적 절단 방식과 여러 가지 서로 다른 효소 혼합물을 비교했습니다. 그들의 목표는 단순히 세포를 꺼내는 것이 아니라, 뇌의 다양한 거주자들의 다양성을 보존하면서 세포를 살아있는 상태로 온전하게 추출하는 것이었습니다. 그들은 기계적 힘만을 사용하는 방법, 더 강력한 효소인 아큐테이스(Accutase), 그리고 파파인(papain), 콜라게나제(collagenase), 디스파제(dispase)를 포함한 세 가지 부드러운 효소 조합(이들은 엉킨 DNA를 끊어 응집을 방지하는 효소와 함께 혼합됨)을 테스트했습니다. 또한 그들은 샘-플을 정화하는 데 흔히 사용되는 단계인, 두꺼운 겔을 통해 액체를 회전시켜 무거운 찌꺼기를 분리하는 과정도 테스트했습니다.

연구진은 부드러운 효소 혼합물이 더 거친 방법들과 마찬가지로 살아있는 세포를 생성하는 데 있어 효과적이라는 것을 발견했습니다. 약 100밀리그램의 뇌 조직을 처리했을 때, 그들은 백질이나 회백질 여부에 관계없이 일관되게 약 40만 개의 살아있는 세포를 회수했습니다. 사용된 부드러운 효소의 종류가 세포 수확 총량에 유의미한 변화를 주지는 않았습니다. 그러나 이 연구는 세척 단계에 대해 명확한 경고를 전달했습니다. 연구진이 찌꺼기를 제거하기 위해 두꺼운 겔을 사용했을 때, 살아있는 세포의 거의 90%를 잃었습니다. 이 세척 과정을 견뎌낸 소수의 세포들은 원래 조직을 공정하게 대변하지 못했습니다. 이 과정은 신경 섬유를 감싸는 지지 세포와 같은 특정 세포 유형을 선택적으로 제거한 반면, 면역 세포의 비율은 높게 남겨두었기 때문입니다. 이는 뇌의 전체적인 세포 경관을 연구해야 하는 연구들에게 이 세척 단계가 역효과를 낼 수 있음을 의미했습니다.

샘플에 정확히 무엇이 들어있는지 확인하기 위해, 팀은 세포를 빛 대신 무거운 금속으로 태깅하여 식별하는 매스 사이토메트리(mass cytometry)라는 강력한 기술을 사용했습니다. 이를 통해 뉴런, 성상교세포, 희소돌기아교세포, 혈관내피세포, 뇌실막세포, 미세아교세포, 백혈구를 포함한 7가지 주요 세포 유형을 계수하고 특성화할 수 있었습니다. 그들은 뇌가 이 세포들의 풍부한 혼합물로 이루어져 있음을 발견했는데, 뉴런이 가장 많았고 그 뒤를 이어 대규모의 지지 세포와 면역 세포가 뒤를 이었습니다. 결정적으로, 그들은 이 세포들을 얼리고 저장했다가 나중에 해동해도 세포 유형의 전반적인 균형을 잃지 않는다는 것을 발견했습니다. 몇몇 특정 지지 세포가 냉동 후 약간 적어졌으나, 주요 그룹들의 상대적 비율은 신선한 샘플과 거의 동일하게 유지되었습니다. 이 발견은 중요한데, 이는 연구자들이 샘플을 서로 다른 시간에 수집하여 함께 분석할 수 있으며, 동물이 희생된 직후에 반드시 실험을 수행해야 하는 압박에서 벗어날 수 있음을 의미하기 때문입니다.

또한 연구팀은 준비 과정이 세포에 스트레스를 주었는지 확인하기 위해 세포의 내부 상태를 조사했습니다. 그들은 세포 분열의 징후와 세포가 스트레스에 반응하고 있음을 나타내는 특정 화학적 신호를 점검했습니다. 그들은 세포 분열이 없음을 확인했는데, 이는 건강한 성체 뇌에서는 예상된 결과이며, 대부분의 스트레스 신호도 낮은 수준을 유지했습니다. 주목할 만한 유일한 변화는 냉동 및 해동 후에 미세아교세포(뇌의 상주 면역 세포) 내에서 특정 스트레스 신호가 일관되게 약간 증가했다는 점이었습니다. 이는 세포가 생존 가능하고 대표성을 유지하면서도, 냉동 과정이 특히 면역 세포에 대해서는 가벼운 반응을 유발한다는 것을 시사합니다.

궁극적으로, 이 연구는 뇌 조직의 진정한 다양성을 보존하는 표준화된 레시피를 제공합니다. 부드러운 효소가 샘플의 대부분을 파괴하는 찌꺼기 제거 단계 없이도 잘 작동한다는 것을 보여줌으로써, 그리고 세포를 얼려도 그 정체성을 잃지 않는다는 것을 확인함으로써, 연구진은 뇌를 연구하는 데 있어 큰 장벽을 제거했습니다. 이들의 접근 방식은 과학자들이 이전에는 어려웠던 방식으로 뉴런과 면역 세포 간의 복잡한 상호작용을 조사할 수 있게 해주며, 가혹한 준비 방법으로 인한 왜곡 없이 뇌의 내부 작동 원리를 더 명확하게 볼 수 있게 해줍니다.