Single Cell Cytometry of Mouse Brain Tissue

O cérebro é uma rede densa e intrincada onde bilhões de células se agrupam, envoltas em isolamento gorduroso e sustentadas por uma complexa teia de proteínas estruturais. Para estudar essas células individualmente, os cientistas devem primeiro separá-las dessa matriz pegajosa, transformando um pedaço sólido de tecido em um líquido de células únicas e fluído. Esse processo, conhecido como dissociação, é notoriamente difícil para o cérebro porque suas células são tão fortemente ligadas e frágeis; se puxar com muita força, as células morrem ou perdem as próprias características que os pesquisadores precisam ver. Durante décadas, os cientistas lutaram para encontrar um método que desestruturasse o tecido sem destruir as delicadas células em seu interior, um desafio que limitou nossa capacidade de entender como a diversa população de neurônios e células imunes do cérebro funciona na saúde e na doença.

Uma equipe de pesquisadores da University of Colorado Anschutz Medical Campus mapeou agora um caminho confiável através dessa dificuldade. Eles se propuseram a testar diversas maneiras de transformar tecido cerebral de camundongo adulto em uma suspensão de célula única, comparando o corte mecânico simples contra várias misturas de enzimas diferentes. O objetivo deles não era apenas tirar as células, mas tirá-las vivas e intactas, preservando a diversidade total de seus habitantes cerebrais. Eles testaram métodos que usavam apenas força mecânica, uma enzima mais forte chamada Accutase, e três combinações de enzimas mais suaves envolvendo papaína, colagenase e dispase, todas misturadas com uma enzima que corta o DNA emaranhado para evitar o agrupamento. Eles também testaram uma etapa comum usada para limpar a amostra: girar o líquido através de um gel espesso para separar os detritos pesados das células.

Os pesquisadores descobriram que as misturas de enzimas suaves funcionaram tão bem quanto os métodos mais agressivos na produção de células vivas. Quando processaram cerca de cem miligramas de tecido cerebral, recuperaram aproximadamente quatrocentas mil células vivas, um número que foi consistente independentemente de estarem observando a substância branca ou a substância cinzenta. O tipo específico de enzima suave usado não alterou significamente o número total de células que eles puderam colher. No entanto, o estudo entregou um aviso claro sobre a etapa de limpeza. Quando os pesquisadores usaram o gel espesso para remover detritos, perderam quase noventa por cento de suas células vivas. As poucas células que sobreviveram a essa lavagem não eram uma representação fiel do tecido original; o processo havia removido seletivamente certos tipos de células, como as células de suporte que envolvem as fibras nervosas, enquanto deixava para trás uma proporção maior de células imunes. Isso significava que, para estudos que exigem um quadro completo do panorama celular do cére-bro, essa etapa de limpeza era contraproducente.

Para ver exatamente o que havia em suas amostras, a equipe utilizou uma tecnologia poderosa chamada citometria de massa, que identifica as células marcando-as com metais pesados em vez de luz. Isso permitiu contar e caracterizar sete tipos principais de células, incluindo neurônios, astrócitos, oligodendrócitos, células endoteliais, células ependimais, microglia e leucócitos. Eles descobriram que o cérebro continha uma rica mistura dessas células, sendo os neurônios os mais abundantes, seguidos por uma grande população de células de suporte e células imunes. Crucialmente, descobriram que podiam congelar essas células, armazená-las e descongelá-las mais tarde sem perder o equilíbrio geral dos tipos celulares. Embora algumas células de suporte específicas fossem ligeiramente menos comuns após o congelamento, as proporções relativas dos principais grupos permaneceram quase idênticas às das amostras frescas. Essa descoberta é significativa porque significa que os pesquisadores podem coletar amostras em diferentes momentos e analisá-las juntas, em vez de serem forçados a realizar cada experimento imediatamente após o sacrifício do animal.

O estudo também observou o estado interno das células para ver se o processo de preparação as havia estressado. Eles verificaram sinais de divisão celular e sinais químicos específicos que indicam que uma célula está reagindo ao estresse. Descobriram que não havia células em divisão, o que é esperado em um cérebro adulto saudável, e a maioria dos sinais de estresse permaneceu baixo. A única mudança notável foi um aumento pequeno e consistente em um sinal de estresse específico dentro da microglia, as células imunes residentes do cérebro, após o congelamento e descongelamento. Isso sugere que, embora as células permaneçam viáveis e representativas, o processo de congelamento desencadeia uma reação leve especificamente nas células imunes.

Em última análise, este trabalho fornece uma receita padronizada para preparar tecido cerebral de camundongo que preserva a verdadeira diversidade do órgão. Ao mostrar que enzimas suaves funcionam bem sem a necessidade de uma etapa de remoção de detritos que destrói a maior parte da amostra, e ao confirmar que as células podem ser congeladas sem perder sua identidade, os pesquisadores removeram uma barreira importante para o estudo do cérebro. A abordagem deles permite que os cientistas examinem as complexas interações entre neurônios e células imunes de uma forma que antes era difícil, oferecendo uma visão mais clara do funcionamento interno do cérebro sem a distorção causada por métodos de preparação agressivos.