Single Cell Cytometry of Mouse Brain Tissue

El cerebro es una red densa e intrincada donde miles de millones de células se aferran entre sí, envueltas en un aislamiento graso y sostenidas por una compleja red de proteínas estructurales. Para estudiar estas células individualmente, los científicos primero deben separarlas de esta matriz pegajosa, convirtiendo un trozo sólido de tejido en un líquido de células individuales que fluye libremente. Este proceso, conocido como disociación, es notoriamente difícil para el cerebro porque sus células están tan estrechamente unidas y son tan frágiles; si se tira demasiado fuerte, las células mueren o pierden las mismas características que los investigadores necesitan observar. Durante décadas, los científicos han luchado por encontrar un método que descomponga el tejido sin destruir las delicadas células en su interior, un desafío que ha limitado nuestra capacidad para comprender cómo funcionan la diversa población de neuronas y células inmunitarias del cerebro en la salud y la enfermedad.

Un equipo de investigadores del Anschutz Medical Campus de la Universidad de Colorado ha trazado ahora un camino fiable a través de esta dificultad. Se propusieron probar diversas formas de convertir el tejido cerebral de ratón adulto en una suspensión de célula única, comparando el picado mecánico simple contra varias mezclas de enzimas diferentes. Su objetivo no era solo extraer las células, sino extraerlas vivas e intactas, preservando la plena diversidad de los habitantes del cerebro. Probaron métodos que utilizaban únicamente la fuerza mecánica, una enzima más fuerte llamada Accutase, y tres combinaciones de enzimas más suaves que involucraban papaína, colagenasa y dispasa, todas mezcladas con una enzima que corta el ADN enredado para evitar la formación de grumos. También probaron un paso común utilizado para limpiar la muestra: pasar el líquido a través de un gel espeso para separar los desechos pesados de las células.

Los investigadores descubrieron que las mezclas de enzimas suaves funcionaban tan bien como los métodos más agresivos para producir células vivas. Cuando procesaron unos cien miligramos de tejido cerebral, recuperaron aproximadamente cuatrocientas mil células vivas, un número que era constante tanto si observaban la sustancia blanca como la sustancia gris. El tipo específico de enzima suave utilizada no cambió significamente el número total de células que podían recolectar. Sin embargo, el estudio lanzó una advertencia clara sobre el paso de limpieza. Cuando los investigadores utilizaron el gel espeso para eliminar los desechos, perdieron casi el noventa por ciento de sus células vivas. Las pocas células que sobrevivieron a este lavado no eran una representación fiel del tejido original; el proceso había eliminado selectivamente ciertos tipos de células, como las células de soporte que envuelven las fibras nerviosas, mientras dejaba atrás una mayor proporción de células inmunitarias. Esto significaba que, para los estudios que requieren una imagen completa del paisaje celular del cerebro, este paso de limpieza resultaba contraproducente.

Para ver exactamente qué había en sus muestras, el equipo utilizó una tecnología poderosa llamada citometría de masas, que identifica las células marcándolas con metales pesados en lugar de luz. Esto les permitió contar y caracterizar siete tipos principales de células, incluyendo neuronas, astrocitos, oligodendrocitos, células endoteliales, células ependimarias, microglía y leucocitos. Descubrieron que el cerebro contenía una rica mezcla de estas células, siendo las neuronas las más abundantes, seguidas de una gran población de células de soporte y células inmunitarias. Crucialmente, descubrieron que podían congelar estas células, almacenarlas y descongelarlas más tarde sin perder el equilibrio general de los tipos de células. Aunque algunas células de soporte específicas eran ligeramente menos comunes después de la congelación, las proporciones relativas de los grupos principales permanecieron casi idénticas a las de las muestras frescas. Este hallazgo es significativo porque significa que los investigadores pueden recolectar muestras en diferentes momentos y analizarlas juntas, en lugar de verse obligados a realizar cada experimento inmediatamente después de sacrificar al animal.

El estudio también analizó el estado interno de las células para ver si el proceso de preparación las había estresado. Comprobaron signos de división celular y señales químicas específicas que indican que una célula está reaccionando al estrés. No encontraron células en división, lo cual es de esperar en un cerebro adulto sano, y la mayoría de las señales de estrés se mantuvieron bajas. El único cambio notable fue un aumento pequeño y constante de una señal de estrés específica dentro de la microglía, las células inmunitarias residentes del cerebro, después de haber sido congeladas y descongeladas. Esto sugiere que, si bien las células siguen siendo viables y representativas, el proceso de congelación sí desencadena una reacción leve en las células inmunitarias específicamente.

En última instancia, este trabajo proporciona una receta estandarizada para preparar tejido cerebral de ratón que preserva la verdadera diversidad del órgano. Al demostrar que las enzimas suaves funcionan bien sin necesidad de un paso de eliminación de desechos que destruye la mayor parte de la muestra, y al confirmar que las células pueden congelarse sin perder su identidad, los investigadores han eliminado una barrera importante para el estudio del cerebro. Su enfoque permite a los científicos examinar las complejas interacciones entre las neuronas y las células inmunitarias de una manera que antes era difícil, ofreciendo una visión más clara del funcionamiento interno del cerebro sin la distorsión causada por los métodos de preparación agresivos.