Single Cell Cytometry of Mouse Brain Tissue

Le cerveau est un réseau dense et complexe où des milliards de cellules s'agglutinent, enveloppées d'une isolation graisseuse et soutenues par une toile complexe de protéines structurelles. Pour étudier ces cellules individuellement, les scientifiques doivent d'abord les séparer de cette matrice collante, transformant un morceau de tissu solide en un liquide de cellules uniques en libre circulation. Ce processus, appelé dissociation, est notoirement difficile pour le cerveau car ses cellules sont si étroitement liées et fragiles ; si l'on tire trop fort, les cellules meurent ou perdent les caractéristiques mêmes que les chercheurs cherchent à observer. Pendant des décennies, les scientifiques ont lutté pour trouver une méthode capable de décomposer le tissu sans détruire les cellules délicates qu'il contient, un défi qui a limité notre capacité à comprendre comment la diversité de la population cellulaire du cerveau, composée de neurones et de cellules immunites, fonctionne en bonne santé et en cas de maladie.

Une équipe de chercheurs de l'University of Colorado Anschutz Medical Campus a désormais tracé une voie fiable pour surmonter cette difficulté. Ils ont entrepris de tester diverses manières de transformer du tissu cérébral de souris adulte en une suspension de cellules uniques, comparant le simple hachage mécanique à plusieurs mélanges enzymatiques différents. Leur objectif n'était pas seulement d'extraire les cellules, mais de les extraire vivantes et intactes, en préservant toute la diversité des habitants du cerveau. Ils ont testé des méthodes utilisant uniquement la force mécanique, une enzyme plus forte appelée Accutase, ainsi que trois combinaisons d'enzymes plus douces impliquant la papaine, la collagénase et la dispase, toutes mélangées à une enzyme qui décompose l'ADN emmêlé pour éviter l'agglutination. Ils ont également testé une étape courante utilisée pour nettoyer l'échantillon : faire passer le liquide à travers un gel épais pour séparer les débris lourds des cellules.

Les chercheurs ont découvert que les mélanges enzymatiques doux fonctionnaient tout aussi bien que les méthodes plus dures pour produire des cellules vivantes. Lorsqu'ils ont traité environ cent milligrammes de tissu cérébral, ils ont récupéré environ quatre cent mille cellules vivantes, un nombre constant, qu'ils observaient dans la substance blanche ou la substance grise. Le type spécifique d'enzyme douce utilisé ne modifiait pas de manière significative le nombre total de cellules récoltées. Cependant, l'étude a lancé un avertissement clair concernant l'étape de nettoyage. Lorsque les chercheurs ont utilisé le gel épais pour éliminer les débris, ils ont perdu près de quatre-vingt-dix pour cent de leurs cellules vivantes. Les rares cellules ayant survécu à ce lavage n'étaient pas une représentation fidèle du tissu d'origine ; le processus avait éliminé sélectivement certains types de cellules, comme les cellules de soutien qui enveloppent les fibres nerveuses, tout en laissant derrière lui une proportion plus élevée de cellules immunitaires. Cela signifiait que pour les études nécessitant une image complète du paysage cellulaire du cerveau, cette étape de nettoyage était contre-productive.

Pour voir exactement ce qui composait leurs échantillons, l'équipe a utilisé une technologie puissante appelée cytométrie de masse, qui identifie les cellules en les marquant avec des métaux lourds plutôt qu'avec de la lumière. Cela a permis de compter et de caractériser sept types majeurs de cellules, notamment les neurones, les astrocytes, les oligodendrocytes, les cellules endothéliales, les cellules épendymaires, la microglie et les leucocytes. Ils ont découvert que le cerveau contenait un mélange riche de ces cellules, les neurones étant les plus abondants, suivis d'une large population de cellules de soutien et de cellules immunitaires. Crucialement, ils ont constaté qu'ils pouvaient congeler ces cellules, les stocker et les décongeler plus tard sans perdre l'équilibre global des types cellulaires. Bien que quelques cellules de soutien spécifiques soient légèrement moins communes après la congélation, les proportions relatives des groupes majeurs restaient presque identiques aux échantillons frais. Cette découverte est significative car elle signifie que les chercheurs peuvent collecter des échantillons à différents moments et les analyser ensemble, plutôt que d'être contraints de réaliser chaque expérience immédiatement après le sacrifice de l'animal.

L'étude a également examiné l'état interne des cellules pour voir si le processus de préparation les avait stressées. Ils ont recherché des signes de division cellulaire et des signaux chimiques spécifiques indiquant qu'une cellule réagit au stress. Ils n'ont trouvé aucune cellule en division, ce qui est attendu dans un cerveau adulte sain, et la plupart des signaux de stress sont restés faibles. Le seul changement notable était une augmentation légère et constante d'un signal de stress spécifique au sein de la microglie, les cellules immunitaires résidentes du cerveau, après la congélation et la décongélation. Cela suggère que, bien que les cellules restent viables et représentatives, le processus de congélation déclenche une réaction modérée dans les cellules immunitaires spécifiquement.

En fin de compte, ce travail fournit une recette standardisée pour préparer le tissu cérébral de souris qui préserve la véritable diversité de l'organe. En démontrant que les enzymes douces fonctionnent bien sans nécessiter une étape d'élimination des débris qui détruit la majeure partie de l'échantillon, et en confirmant que les cellules peuvent être congelées sans perdre leur identité, les chercheurs ont levé un obstacle majeur à l'étude du cerveau. Leur approche permet aux scientifiques d'examiner les interactions complexes entre les neurones et les cellules immunitaires d'une manière qui était auparavant difficile, offrant une vue plus claire des rouages internes du cerveau sans la distorsion causée par les méthodes de préparation agressives.