Single Cell Cytometry of Mouse Brain Tissue

Das Gehirn ist ein dichtes, komplexes Netzwerk, in dem sich Milliarden von Zellen aneinanderklammern, umhüllt von fettiger Isolierung und gestützt durch ein komplexes Geflecht aus Strukturproteinen. Um diese Zellen einzeln zu untersuchen, müssen Wissenschaftler sie zunächst von dieser klebrigen Matrix trennen, indem sie ein festes Stück Gewebe in eine freifließende Flüssigkeit aus Einzelzellen verwandeln. Dieser Prozess, bekannt als Dissoziation, ist für das Gehirn besonders schwierig, da seine Zellen so eng miteinander verbunden und fragil sind; zieht man zu stark, sterben die Zellen oder verlieren genau jene Merkmale, die Forscher sehen wollen. Jahrzehntelang kämpften Wissenschaftler darum, eine Methode zu finden, die das Gewebe auseinanderbricht, ohne die empfindlichen Zellen im Inneren zu zerstören – eine Herausforderung, die unsere Fähigkeit eingeschränkt hat, die Funktion der vielfältigen Population von Neuronen und Immunzellen des Gehirns in gesundem und krankem Zustand zu verstehen.

Einem Team von Forschern der University of Colorado Anschutz Medical Campus ist es nun gelungen, einen zuverlässigen Weg durch diese Schwierigkeit aufzuzeigen. Sie unternahmen den Versuch, verschiedene Arten zu testen, um adultes Mausgehirngewebe in eine Einzelzell-Suspension zu verwandeln, wobei sie einfaches mechanisches Zerkleinern gegen mehrere verschiedene Enzymmischungen abwogen. Ihr Ziel war nicht nur, die Zellen herauszubekommen, sondern sie lebend und intakt zu extrahieren und dabei die volle Vielfalt der Bewohner des Gehirns zu bewahren. Sie testeten Methoden, die allein mechanische Kraft nutzten, ein stärkeres Enzym namens Accutase sowie drei sanftere Enzymkombinationen bestehend aus Papain, Collagenase und Dispase, jeweils gemischt mit einem Enzym, das verhedderte DNA aufspaltet, um Verklumpungen zu verhindern. Sie testten auch einen gängigen Schritt, der zur Reinigung der Probe verwendet wird: das Zentrifugieren der Flüssigkeit durch ein dickes Gel, um schweres Debris von den Zellen zu trennen.

Die Forscher fanden heraus, dass die sanften Enzymmischungen ebenso gut wie die härteren Methoden bei der Erzeugung lebender Zellen funktionierten. Wenn sie etwa einhundert Milligramm Gehirngewebe verarbeiteten, gewannen sie etwa vierhunderttausend lebende Zellen, eine Zahl, die konsistent war, unabhängig davon, ob sie die weiße oder die graue Substanz betrachteten. Die spezifische Art des verwendeten sanften Enzyms änderte die Gesamtzahl der geernteten Zellen nicht signifikant. Die Studie gab jedoch eine deutliche Warnung bezüglich des Reinigungsschritts ab. Als die Forscher das dicke Gel verwendeten, um Debris zu entfernen, verloren sie fast neunzig Prozent ihrer lebenden Zellen. Die wenigen Zellen, die diese Wäsche überlebten, waren keine repräsentative Darstellung des ursprünglichen Gewebes; der Prozess hatte bestimmte Zelltypen, wie etwa die Stützzellen, die die Nervenfasern umhüllen, selektiv entfernt, während ein höherer Anteil an Immunzellen zurückblieb. Dies bedeutete, dass dieser Reinigungsschritt für Studien, die ein vollständiges Bild der zellulären Landschaft des Gehirns erfordern, kontraproduktiv war.

Um genau zu sehen, was in ihren Proben enthalten war, nutzte das Team eine leistungsstarke Technologie namens Massenzytometrie, welche die Zellen identifiziert, indem sie sie mit schweren Metallen anstatt mit Licht markiert. Dies ermöglichte es ihnen, sieben Hauptzelltypen zu zählen und zu charakterisieren, darunter Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten, Endothelzellen, Ependymzellen, Mikroglia und Leukozyten. Sie entdeckten, dass das Gehirn eine reiche Mischung dieser Zellen enthält, wobei Neuronen am häufigsten vorkamen, gefolgt von einer großen Population von Stützzellen und Immunzellen. Entscheidend war, dass sie diese Zellen einfrieren, lagern und später auftauen konnten, ohne die allgemeine Balance der Zelltypen zu verlieren. Zwar waren einige spezifische Stützzellen nach dem Einfrieren etwas seltener vertreten, doch die relativen Anteile der Hauptgruppen blieben fast identisch mit den Frischproben. Dieser Befund ist bedeutsam, da er bedeutet, dass Forscher Proben zu unterschiedlichen Zeiten sammeln und gemeinsam analysieren können, anstatt gezwungen zu sein, jedes Experiment unmittelbar nach der Tötung des Tieres durchzuführen.

Die Studie untersuchte auch den internen Zustand der Zellen, um zu sehen, ob der Aufbereitungsprozess sie gestresst hatte. Sie prüften auf Anzeichen von Zellteilung und spezifische chemische Signale, die darauf hindeuten, dass eine Zelle auf Stress reagiert. Sie fanden keine teilenden Zellen, was in einem gesunden adulten Gehirn zu erwarten ist, und die meisten Stresssignale blieben niedrig. Die einzige bemerkenswerte Veränderung war ein kleiner, konsistenter Anstieg eines spezifischen Stresssignals innerhalb der Mikroglia, den residenten Immunzellen des Gebrins, nach dem Einfrieren und Auftauen. Dies deutet darauf hin, dass die Zellen zwar lebensfähig und repräsentativ bleiben, der Gefrierprozess jedoch eine milde Reaktion in den Immunzellen spezifisch auslöst.

Letztlich bietet diese Arbeit ein standardisiertes Rezept für die Aufbereitung von Mausgehirngewebe, das die wahre Vielfalt des Organs bewahrt. Indem sie zeigten, dass sanfte Enzyme gut funktionieren, ohne dass ein Debris-Entfernungsschritt nötig ist, der den Großteil der Probe zerstört, und indem sie bestätigten, dass Zellen eingefroren werden können, ohne ihre Identität zu verlieren, haben die Forscher eine große Barriere für die Untersuchung des Gehirns beseitigt. Ihr Ansatz ermöglicht es Wissenschaftlern, die komplexen Interaktionen zwischen Neuronen und Immunzellen auf eine Weise zu untersuchen, die zuvor schwierig war, und bietet eine klarere Sicht auf die inneren Vorgänge des Gehirns, ohne die durch harte Aufbereitungsmethoden verursachte Verzerrung.