Single Cell Cytometry of Mouse Brain Tissue

脳は、数十億の細胞が脂肪の絶縁体に包まれ、複雑な構造タンパク質の網によって支えられながら、互いに寄り添い合う、高密度で複雑なネットワークです。これらの細胞を個別に研究するためには、まずこれらを粘着性のマトリックスから分離し、固形組織を単一細胞の流動的な液体へと変えなければなりません。「解離」として知られるこのプロセスは、脳においては極めて困難であることで有名です。なぜなら、脳細胞は非常に密接に結合しており、かつ脆弱だからです。強く引きすぎてしまうと、細胞は死滅するか、あるいは研究者が観察する必要としているまさにその特徴を失ってしまうのです。数十年にわたり、科学者たちは、内部の繊細な細胞を破壊することなく組織を分解する方法を見つけ出そうと苦心してきました。この課題が、健康時および疾患時における脳の多様なニューロンや免疫細胞の機能を理解する上での制限となってきました。

コロラド大学アンシュッツ・メディカル・キャンパスの研究チームは、この困難な課題を克服するための信頼できる経路を新たに描き出しました。彼らは、成体のマウス脳組織を単一細胞懸濁液に変えるための様々な方法をテストし、単純な機械的切断と、数種類の異なる酵素混合物の比較を行いました。彼らの目的は、単に細胞を取り出すことではなく、細胞を生きたまま、かつ完全な状態で取り出し、脳に存在する多様な住民の姿を維持することでした。彼らは、機械的な力のみを用いる方法、より強力な酵素であるアクタケース（Accutase）、そしてパパイン、コラゲナーゼ、ディスパーゼを含む、絡まり合ったDNAを分解して凝集を防ぐ酵素を混ぜた3種類のより穏やかな酵素の組み合わせをテストしました。また、サンプルを洗浄するために一般的に用いられる工程、すなわち、厚いゲルを通して液体を回転させ、重いデブリ（残渣）から細胞を分離させるステップについてもテストを行いました。

研究者たちは、穏やかな酵素混合物が、細胞を生きた状態で産出するという点において、より強力な手法と同等の成果を上げることを見出しました。約100ミリグラムの脳組織を処理した際、彼らは約40万個の生細胞を回収しましたが、この数値は白質を見ている場合でも灰白質を見ている場合でも一貫していました。使用した特定の穏やかな酵素の種類によって、収穫できる総細胞数に大きな変化はありませんでした。しかし、本研究は、洗浄工程に関する明確な警告を発しました。デブリを除去するために厚いゲルを使用したところ、生細胞のほぼ9割が失われました。この洗浄工程を生き延びたわずかな細胞は、元の組織を正しく代表するものではありませんでした。このプロセスは、神経線維を包む支持細胞などの特定の細胞種を選択的に除去し、一方で免疫細胞の割合を高く残してしまうためです。これは、脳の細胞景観の全体像を必要とする研究にとって、この洗浄工程が逆効果であることを意味していました。

サンプルの中に何が含まれているかを正確に把握するために、チームは「マスサイトメトリー」と呼ばれる強力な技術を用いました。これは、光の代わりに重金属でタグ付けすることで細胞を識別する技術です。これにより、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、血管内皮細胞、エペンディマル細胞、ミクログリア、ロイコサイトを含む7つの主要な細胞タイプをカウントし、特性を特定することができました。彼らは、脳にはこれらの細胞が豊富に混在していることを発見しました。ニューロンが最も豊富であり、次いで大量の支持細胞と免疫細胞が存在しています。決定的なことに、これらの細胞を凍結・保存し、後で解凍しても、細胞タイプの全体的なバランスを損なわないことが分かりました。一部の特定の支持細胞は凍結後にわずかに減少しましたが、主要なグループの相対的な割合は、新鮮なサンプルとほぼ同一のままでした。この発見は重要です。なぜなら、研究者が異なる時期にサンプルを収集し、それらをまとめて解析できることを意味しており、動物を屠殺した直後にすべての実験を行わなければならないという制約を取り払うものだからです。

研究チームは、細胞の内部状態についても調査し、調製プロセスが細胞にストレスを与えていないかを確認しました。彼らは細胞分裂の兆候や、細胞がストレスに反応していることを示す特定の化学信号をチェックしました。その結果、分裂中の細胞は見つからず（これは健康な成体脳においては予想通りです）、ほとんどのストレス信号は低いレベルに留まっていました。唯一注目すべき変化は、凍結および解凍の後に、ミクログリア（脳の常在免疫細胞）において特定のストレス信号がわずかに、かつ一貫して増加したことでした。これは、細胞が生存可能であり、かつ代表性を維持している一方で、凍結プロセスが免疫細胞に対して特異的に軽微な反応を引き起こすことを示唆しています。

最終的に、この研究は、マウスの脳組織を調製するための標準化されたレシピを提供します。穏やかな酵素が、サンプルの大部分を破壊するデブリ除去工程を必要とせずに優れた効果を発揮することを示し、さらに、細胞のアイデンティティを失うことなく凍結が可能であることを確認したことで、研究者たちは脳研究における大きな障壁を取り除きました。彼らのアプローチにより、科学者は、以前は困難であった、ニューロンと免疫細胞の複雑な相互作用を検証できるようになります。これにより、過酷な調製方法による歪みのない、脳の内部構造のより鮮明な姿を見ることが可能になるのです。