How robust are transcriptomics-based points of departure when translated to in vivo doses by kinetic-modeling? A case study with the herbicide pendimethalin using HepG2 and HepaRG cells

ملخص تقني: متانة نقاط الانقطاع القائمة على النسخ المتماثلة لمركب بنديميثالين

بيان المشكلة
تعتمد تقييمات المخاطر التقليدية للمواد الكيميائية الزراعية بشكل كبير على الدراسات الحيوانية في الجسم الحي (in vivo) لاستخلاص نقاط الانقطاع (PODs) من أجل القيم التوجيهية التنظيمية. وبينما توفر منهجيات النهج الجديد (NAMs) مساراً لتقدير مستويات التعرض الواقية دون الحاجة إلى بيانات حيوانية جديدة، فإن أداءها التنبؤي ومتانتها يتطلبان التحقق من صحتها مقابل النتائج المرجعية الراسخة في الجسم الحي. وتحديداً، هناك حاجة لتقييم ما إذا كان يمكن لمنهجيات النسخ المتماثل (transcriptomics)، عند دمجها مع نمذجة الحركية الفسيولوجية القائمة على الفيزيولوجيا (PBK) للاستقراء من في المختبر إلى في الجسم الحي (IVIVE)، أن تولد عتبات سمية جهازية ذات منطقية بيولوجية. علاوة على ذلك، لا يزال حجم المساهمة النسبية لعدم اليقين الناتج عن نمذجة الحركية السمية مقابل تحليل بيانات النسخ المتماثل غير واضح.

المنهجية
استخدمت هذه الحالة الدراسية مركب بنديميثالين (PDM)، وهو مادة كيميائية زراعية ذات بيانات مرجعية سمية وحركية واسعة النطاق، لتقييم سير عمل قائم على النسخ المتماثل (NAM). وظفت الدراسة نموذجين مختلفين من خلايا الكبد ومنصات النسخ المتماثل:

1. نماذج الخلايا: خلاًيا HepG2 (خلايا سرطانية كبدية مستمرة) وخلايا HepaRG (خلايا جذعية كبدية متمايزة).
2. منصات النسخ المتماثل: تقنية TempO-Seq المستهدفة في خلايا HepG2، وتسلسل RNA غير المستهدف في خلايا HepaRG.
3. التعرض: تعرضت الخلايا للبنديميثالين لمدة 48 ساعة عبر نطاقات تركيز (0.07–202 ميكرومولار لـ HepaRG؛ 0.8–56 ميكرومولار لـ HepG2)، تم اختيارها بناءً على حدود السمية الخلوية (IC25).
4. اشتقاق tPOD: تم تحليل تغيرات التعبير الجيني باستخدام BMDExpress 3.0. طُبقت أربعة مقاربات إحصائية لاشتقاق نقاط الانقطاع النسخية (tPODs):
   • تركيز العتبة (BMC) للجين رقم 25.
     ^{*} المئوي الخامس من توزيع الـ BMC.
   • النمط (mode) الأول لتوزيع كثافة الـ BMC.
   • مستوى عدم ملاحظة التأثير النسخي (NOTEL-5)، والذي عُرِّف بأنه أعلى تركيز يحتوي على أقل من 5 جينات متغيرة التعبير.
5. الاستقراء (IVIVE) ونمذجة PBK: تمت ترجمة مشتقات tPODs إلى جرعات خارجية باستخدام الجرعات العكسية. استُخدمت ثلاثة نماذج PBK مختلفة للجرذان: حزمة httk التابعة لوكالة حماية البيئة (EPA)، وأداة TK-Plate عبر الإنترنت التابعة للهيئة الأوروبية لسلامة الأغذية (EFSA)، ونموذج TK-Estimator الداخلي المكون من 9 مقصورات والتابع لشركة BASF.
6. نمذجة المجتمع البشري: استُخدم نموذج PBK القائم على المجتمع البشري (باستخدام حزمة httk مع مجتمع افتراضي يضم 100,000 فرد) لاشتقاق الجرعة المكافئة عن طريق الفم (OED) عند المئوي الخامس من أكثر tPOD حساسية.
7. تحليل الحساسية: تم حساب معاملات الحساسية لمعاملات الإدخال الرئيسية (الكسر غير المرتبط، logKow، التصفية الذاتية، والنفاذية الظاهرية) لتقييم تأثيرها على تنبؤات التركيز الأقصى للبلازما ($C_{max}$).

النتائج الرئيسية

• الحساسية النسخية: رصدت كل من خطوط الخلايا والمنصات تغيرات في التعبير الجيني تعتمد على التركيز. وكان أكثر tPOD حساسية تم تحديده هو 0.65 ميكرومولار (25th gene BMC في HepG2 عبر TempO-Seq)، بينما أسفر تحليل RNA-seq لخلايا HepaRG عن أكثر tPOD حساسية قدره 0.68 ميكرومولار (NOTEL-5).
• نقاط الانقطاع المشتقة من IVIVE: عند ترجمتها إلى جرعات خارجية، وقعت نقاط الانقطاع المشتقة من IVIVE عموماً ضمن نطاق نقاط الانقطاع (PODs) المرجعية في الجسم الحي المسجلة للبنديميثالين.
  • قدم التنبؤ الأكثر حساسية للجرذ نقطة انقطاع قدرها 6.0 ملجم/كجم يومياً.
  • أدت نمذجة المجتمع البشري إلى جرعة مكافئة عن طريق الفم (OED) عند المئوي الخامس قدرها 0.068 ملجم/كجم يومياً.
• المقارنة بالقيم التنظيمية: يقترب الـ OED البشري المتوقع (0.068 ملجم/كجم يومياً) من الجرعة اليومية المقبولة (ADI) المحددة بـ 0.15 ملجم/كجم يومياً، ومن مستوى التعرض المقبول للمشغل (AOEL) البالغ 0.17 ملجم/كجم يومياً. كما تتوافق نقطة الانقطاع (POD) للجرذ (6.0 ملجم/كجم يومياً) مع مستوى الجرعة التي لا يلاحظ فيها تأثير (NOAEL) البالغ 12.5 ملجم/كجم يومياً والمستخلص من دراسة مزمنة على الكلاب (والتي استُخدمت لتحديد الـ ADI).
• مصادر التباين: وُجد أن التباين الناتج عن اختيار نموذج الحركية السمية (PBK) هو من نفس حجم التباين المرتبط بمقاربات تحليل البيانات النسخية المختلفة (خط الخلايا، المنصة، والمنهج الإحصائي). وأشار تحليل الحساسية إلى أن معاملات الامتصاص والتقسيم (تحديداً $P_{app}$ و logKow) كانت المحركات الرئيسية لعدم اليقين في التنبؤات الحركية.
• أداء النموذج: كانت قيم تركيز البلازما ($C_{max}$) المتوقعة من نماذج PBK ضمن نطاق 0.5 إلى 1.0 ضعف من البيانات المقاسة في الجسم الحي للجرذ بعد جرعة فموية واحدة، مما يقع ضمن نطاق الدقة المقبول لنماذج PBPK المؤهلة.

الأهمية والادعاءات
يدعي المؤلفون أن هذه الدراسة تدعم جدوى دمج النسخ المتماثل في المختبر مع IVIVE لتقدير عتبات السمية الجهازية للمواد الكيميائية الزراعية. وتشير النتائج إلى أن سير عمل (NAM) القائم على النسخ المتماثل يمكن أن يوفر تقديرات لمستويات التعرض الواقية التي تضاهي تلك المستخلصة من الدراسات التقليدية في الجسم الحي.

ومن الأهمية بمكان، تسلط الورقة الضوء على أن عدم اليقين في IVIVE يساهم بقدر لا يقل عن المساهمة الناتجة عن عدم اليقين في تحليل بيانات النسخ المتماثل. ويؤكد هذا الاكتشاف أن التحسينات في سير عمل تقييم المخاطر من الجيل التالي (NGRA) تعتمد بقدر ما تعتمد على تقدم نمذجة الحركية السمية، والجرعات، وتوصيف المعاملات الحركية، بقدر اعتمادها على صقل منهجيات النسخ المتماثل.

تخلص الدراسة إلى أنه بينما يبدي هذا النهج وعداً في تحديد عتبات السمية الجهازية الواقية، فإن الحاجة إلى تقييم أوسع عبر مجموعة أوسع من المواد الكيميائية الزراعية ومزيد من الصقل المنهجي (بما في ذلك استخدام المعاملات الحركية المحددة تجريبياً والجرعات في المختبر) تظل ضرورية قبل إمكانية إنشاء تطبيق تنظيمي روتيني. ويحافظ المؤلفون على موقف متزن، حيث يقدمون العمل كدراسة حالة لإثبات المفهوم بدلاً من كونه بديلاً نهائياً للأطر التنظيمية الحالية.