How robust are transcriptomics-based points of departure when translated to in vivo doses by kinetic-modeling? A case study with the herbicide pendimethalin using HepG2 and HepaRG cells

Sintesi Tecnica: Robustezza dei Punti di Partenza basati sulla Trascrizionomica per il Pendimethalin

Definizione del Problema
La valutazione tradizionale del rischio per gli agrofarmaci si basa pesantemente su studi in vivo sugli animali per derivare i Punti di Partenza (POD) per i valori guida normativi. Sebbene le Nuove Metodologie di Approccio (NAM) offrano una via per stimare i livelli di esposizione protettivi senza nuovi dati animali, le loro prestazioni predittive e la loro robustezza richiedono una validazione rispetto ai risultati in vivo stabiliti. Nello specifico, è necessario valutare se i flussi di lavoro basati sulla trascrizionomica, combinati con la modellazione cinetica fisiologicamente basata (PBK) per l'estrapolazione in vitro-all'in vivo (IVIVE), possano generare soglie di tossicità sistemica biologicamente plausibili. Inoltre, rimane poco chiaro il contributo relativo dell'incertezza derivante dalla modellazione tossicocinetica rispetto all'analisi dei dati trascrizionomici.

Metodologia
Questo caso di studio ha utilizzato il pendimethalin (PDM), un agrofarmaco con un'ampia disponibilità di dati tossicologici e cinetici di riferimento, per valutare un flusso di lavoro basato sulla trascrizionomica. Lo studio ha impiegato due modelli cellulari in vitro e piattaforme trascrizionomiche distinte:

1. Modelli Cellulari: HepG2 (carcinoma epatocellulare immortalizzato) e HepaRG (cellule staminali epatiche differenziate).
2. Piattaforme Trascrizionomiche: TempO-Seq mirata in cellule HepG2 e sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) non mirato in cellule HepaRG.
3. Esposizione: Le cellule sono state esposte al PDM per 48 ore attraverso intervalli di concentrazione (0,07–202 µM per HepaRG; 0,8–56 µM per HepG2), selezionati in base ai limiti di citotossicità (IC25).
4. Derivazione del tPOD: I cambiamenti nell'espressione genica sono stati analizzati utilizzando BMDExpress 3.0. Sono stati applicati quattro approcci statistici per derivare i Punti di Partenza trascrizionomici (tPOD):
   • 25° percentile della concentrazione di benchmark (BMC) del gene.
   • 5° percentile della distribuzione del BMC.
   • 1° modo della densità del BMC.
   • Livello di effetto trascrizionomico non osservato (NOTEL-5), definito come la concentrazione più alta con meno di 5 geni espressi in modo differenziale.
5. IVIVE e Modellazione PBK: I tPOD derivati sono stati tradotti in dosi esterne tramite dosimetria inversa. Sono stati utilizzati tre distinti modelli PBK per ratti: il pacchetto R httk dell'EPA, lo strumento online TK-Plate dell'EFSA e un TK-Estimator interno a BASF a 9 compartimenti.
6. Modellazione della Popolazione Umana: Un modello PBK basato sulla popolazione umana (utilizzando il pacchetto httk con una popolazione virtuale di 100.000 individui) è stato utilizzato per derivare una Dose Equivalente Orale (OED) al 5° percentile dal tPOD più sensibile.
7. Analisi di Sensibilità: Sono stati calcolati i coefficienti di sensibilità per i parametri di input chiave (frazione non legata, logKow, clearance intrinseca e permeabilità apparente) per valutare il loro impto sulle previsioni della $C_{max}$ plasmatica.

Risultati Chiave

• Sensibilità Trascrizionomica: Entrambe le linee cellulari e le piattaforme hanno rilevato cambiamenti nell'espressione genica dipendenti dalla concentrazione. Il tPOD più sensibile identificato è stato 0,65 µM (25° BMC del gene in HepG2 tramite TempO-Seq), mentre l'analisi RNA-seq di HepaRG ha prodotto un tPOD più sensibile di 0,68 µM (NOTEL-5).
• POD derivati da IVIVE: Quando tradotti in dosi esterne, i POD derivati da IVIVE sono generalmente rientrati nell'intervallo dei POD in vivo normativi riportati per il PDM.
  • La previsione più sensibile per il ratto ha fornito un POD di 6,0 mg/kg bw/giorno.
  • La modellazione della popolazione umana ha prodotto un OED al 5° percentile di 0,068 mg/kg bw/giorno.
• Confronto con i Valori Normativi: L'OED umana predetta (0,068 mg/kg bw/giorno) è vicina all'assunzione giornaliera accettabile (ADI) stabilita di 0,125 mg/kg bw/giorno e al livello di esposizione accettabile per l'operatore (AOEL) di 0,17 mg/kg bw/giorno. Il POD del ratto (6,0 mg/kg bw/giorno) si allinea con il NOAEL di 12,5 mg/kg bw/giorno derivato da uno studio cronico sul cane (utilizzato per l'ADI).
• Fonti di Variabilità: È stato riscontrato che la variabilità introdotta dalla scelta del modello tossicocinetico (PBK) è della stessa entità della variabilità associata ai diversi approcci di analisi trascrizionomica (linea cellulare, piattaforma e metodo statistico). L'analisi di sensibilità ha indicato che i parametri di assorbimento e partizione (specificamente $P_{app}$ e logKow) sono i principali driver dell'incertezza nelle previsioni cinetiche.
• Prestazioni del Modello: I valori di $C_{max}$ plasmatica predetta dai modelli PBK sono rientrati tra 0,5 e 1,0 volte i dati in vivo misurati nei ratti dopo una singola dose orale, rientrando nell'intervallo di accuratezza accettabile per i modelli PBPK qualificati.

Significato e Rivendicazioni
Gli autori sostengono che questo studio supporti la fattibilità di combinare la trascrizionomica in vitro con l'IVIVE per stimare le soglie di tossicità sistemica per gli agrofarmaci. I risultati suggeriscono che i flussi di lavoro NAM basati sulla trascrizionomica possono fornire stime di livelli di esposizione protettivi che sono comparabili a quelli derivati dai tradizionali studi in vivo.

Fondamentalmente, l'articolo evidenzia che l'incertezza nell'IVIVE contribuisce almeno quanto l'incertezza nell'analisi dei dati trascrizionici alla previsione finale. Questa scoperta sottolinea che i miglioramenti nei flussi di lavoro della Valutazione del Rischio di Nuova Generazione (NGRA) dipendono tanto dagli avanzamenti nella modellazione tossicocinetica, nella dosimetria e nella parametrizzazione cinetica quanto dal raffinamento delle metodologie trascrizionomiche.

Lo studio conclude che, sebbene l'approccio sia promettente per l'identificazione di soglie di tossicità sistemica protettive, sono necessarie una valutazione più ampia su una gamma più vasta di agrofarmaci e un ulteriore raffinamento metodologico (inclusi l'uso di parametri cinetici determinati sperimentalmente e la dosimetria in vitro) prima che possa essere stabilita una routine applicazione normativa. Gli autori mantengono una posizione modesta, presentando il lavoro come un caso di studio di prova di concetto piuttosto che come un sostituto definitivo degli attuali quadri normativi.