How robust are transcriptomics-based points of departure when translated to in vivo doses by kinetic-modeling? A case study with the herbicide pendimethalin using HepG2 and HepaRG cells

Resumo Técnico: Robustez de Pontos de Partida Baseados em Transcriptômica para o Pendimetalina

Definição do Problema
A avaliação de risco tradicional para agroquímicos baseia-se fortemente em estudos animais in vivo para derivar Pontos de Partida (PODs) para valores de orientação regulatória. Embora as Metodologias de Novas Abordagens (NAMs) ofereçam um caminho para estimar níveis de exposição protetivos sem novos dados animais, seu desempenho preditivo e robustez requerem validação contra resultados in vivo estabelecidos. Especificamente, há uma necessidade de avaliar se fluxos de trabalho baseados em transcriptômica, quando combinados com modelagem de Cinética Baseada em Fisiologia (PBK) para extrapolação in vitro-para-in vivo (IVIVE), podem gerar limiares de toxicidade sistêmica biologicamente plausíveis. Além disso, a contribuição relativa da incerteza proveniente da modelagem toxicocinética versus a análise de dados transcriptômicos permanece incerta.

Metodologia
Este estudo de caso utilizou a pendimetalina (PDM), um agroquímico com extensos dados de referência toxicológica e cinética existentes, para avaliar um fluxo de trabalho de NAM baseado em transcriptômica. O estudo empregou dois modelos celulares hepáticos e plataformas transcriptômicas distintos:

1. Modelos Celulares: HepG2 (carcinoma hepatocelular imortalizado) e HepaRG (células estaminais hepáticas diferenciadas).
2. Plataformas de Transcriptômica: TempO-Seq direcionado em células HepG2 e sequenciamento de RNA não direcionado em células HepaRG.
3. Exposição: As células foram expostas à PDM por 48 horas em faixas de concentração (0,07–202 µM para HepaRG; 0,8–56 µM para HepG2), selecionadas com base nos limites de citotoxicidade (IC25).
4. Derivação de tPOD: As mudanças na expressão gênica foram analisadas usando o BMDExpress 3.0. Quatro abordagens estatísticas foram aplicadas para derivar Pontos de Partida Transcriptômicos (tPODs):
   • Concentração de Referência (BMC) do 25º gene.
   • Percentil 5 da distribuição de BMC.
   • 1º modo da densidade de distribuição de BMC.
   • Nível de Efeito Transcriptômico Não Observado (NOTEL-5), definido como a concentração mais alta com menos de 5 genes diferencialmente expressos.
5. IVIVE e Modelagem PBK: Os tPODs derivados foram traduzidos para doses externas usando dosimetria reversa. Três modelos de PBK de ratos distintos foram utilizados: o pacote httk de R da EPA, a ferramenta online TK-Plate da EFSA e um TK-Estimator de 9 compartimentos interno da BASF.
6. Modelagem de População Humana: Um modelo PBK baseado na população humana (usando o pacote httk com uma população virtual de 100.000 indivíduos) foi utilizado para derivar uma Dose Equivalente Oral (OED) do 5º percentil a partir do tPOD mais sensível.
7. Análise de Sensibilidade: Coeficientes de sensibilidade foram calculados para parâmetros de entrada chave (fração não ligada, logKow, depuração intrínseca e permeabilidade aparente) para avaliar seu impacto nas predições de $C_{max}$ plasmática.

Resultos Principais

• Sensibilidade Transcriptômica: Ambas as linhagens celulares e plataformas detectaram mudanças na expressão gênica dependentes da concentração. O tPOD mais sensível identificado foi 0,65 µM (BMC do 25º gene em HepG2 via TempO-Seq), enquanto a análise de RNA-seq de HepaRG rendeu um tPOD mais sensível de 0,68 µM (NOTEL-5).
• PODs derivados de IVIVE: Quando traduzidos para doses externas, os PODs derivados de IVIVE geralmente situaram-se dentro da faixa dos PODs in vivo regulatórios relatados para a PDM.
  • A predição mais sensível para o rato rendeu um POD de 6,0 mg/kg bw/dia.
  • A modelagem baseada na população humana resultou em uma OED de 5º percentil de 0,068 mg/kg bw/dia.
• Comparação com Valores Regulatórios: A OED humana prevista (0,068 mg/kg bw/dia) é próxima da Ingestão Diária Aceitável (IDA) estabelecida de 0,125 mg/kg bw/dia e do Nível de Exposição Aceitável para o Operador (NAEO) de 0,17 mg/kg bw/dia. O POD de rato (6,0 mg/kg bw/dia) alinha-se com o NOAEL de 12,5 mg/kg bw/dia derivado de um estudo crônico com cães (usado para a IDA).
• Fontes de Variabilidade: A variabilidade introduzida pela escolha do modelo toxicocinético (PBK) foi encontrada para ser da mesma magnitude da variabilidade associada a diferentes abordagens de análise transcriptômica (linhagem celular, plataforma e método estatístico). A análise de sensibilidade indicou que os parâmetros de absorção e partição (especificamente $P_{app}$ e logKow) foram os principais impulsionadores da incerteza nas predições cinéticas.
• Desempenho do Modelo: Os valores de $C_{max}$ plasmática previstos pelos modelos PBK ficaram dentro de 0,5 a 1,0 vez dos dados in vivo de ratos medidos após uma dose oral única, situando-se dentro da faixa de precisão aceitável para modelos PBPK qualificados.

Significância e Alegações
Os autores alegam que este estudo apoia a viabilidade de combinar transcriptômica in vitro com IVIVE para estimar limiares de toxicidade sistêmica para agroquímicos. Os resultados sugerem que fluxos de trabalho de NAM baseados em transcriptômica podem fornecer estimativas de níveis de exposição protetivos que são comparáveis aos derivados de estudos in vivo tradicionais.

Crucialmente, o artigo destaca que a incerteza no IVIVE contribui pelo menos tanto quanto a incerteza na análise de dados transcriptômicos para a predição final. Esta descoberta ressalta que as melhorias nos fluxos de trabalho de Avaliação de Risco de Próxima Geração (NGRA) dependem tanto do avanço na modelagem toxicocinética, dosimetria e parametrização cinética quanto do refinamento das metodologias transcriptômicas.

O estudo conclui que, embora a abordagem mostre promessa para identificar limiares de toxicidade sistêmica protetivos, avaliações mais amplas através de uma gama mais vasta de agroquímicos e refinamentos metodológicos adicionais (incluindo o uso de parâmetros cinéticos determinados experimentalmente e dosimetria in vitro) são necessários antes que uma aplicação regulatória rotineira possa ser estabelecida. Os autores mantêm uma postura modesta, apresentando o trabalho como um estudo de caso de prova de conceito, em vez de um substituto definitivo para os atuais marcos regulatórios.