How robust are transcriptomics-based points of departure when translated to in vivo doses by kinetic-modeling? A case study with the herbicide pendimethalin using HepG2 and HepaRG cells

技术摘要：基于转录组学的 啶虫辛威 (Pendimethalin) 起点值 (POD) 的稳健性研究

问题陈述
传统的农用化学品风险评估高度依赖于体内动物实验来推导用于监管指导值的起点值 (Points of Departure, POD)。虽然新方法学 (New Approach Methodologies, NAMs) 为在无需新动物数据的情况下估算保护性暴露水平提供了途径，但其预测性能和稳健性需要通过已建立的体内结果进行验证。具体而言，需要评估结合了生理学基础动力学 (PBK) 模型进行体外-向-体内外推 (IVIVE) 的转录组学工作流，是否能够生成具有生物学合理性的全身毒性阈值。此外，来自毒代动力学建模与转录组数据分析的确定性贡献比例仍不明确。

方法学
本案例研究利用了具有广泛现有毒理学和动力学参考数据的农用化学品——啶虫辛威 (PDM)，旨在评估一种基于转录组学的 NAM 工作流。研究采用了两种不同的肝细胞模型和转录组平台：

1. 细胞模型： HepG2（永生化人肝癌细胞）和 HepaRG（分化的肝脏干细胞）。
2. 转录组平台： 在 HepG2 细胞中使用靶向 TempO-Seq 技术，以及在 HepaRG 细胞中使用非靶向 RNA 测序技术。
3. 暴露： 细胞暴露于 PDM 48 小时，浓度范围为 0.07–202 µM (HepaRG) 和 0.8–56 µM (HepG2)，浓度选择基于细胞毒性限值 (IC25)。
4. tPOD 推导： 使用 BMDExpress 3.0 对基因表达变化进行分析。应用了四种统计方法来推导转录组起点值 (tPODs)：
   • 25th 基因基准浓度 (BMC)。
   • BMC 分布的第 5 百分位数。
   • BMC 密度分布的第 1 个众数。
   • 无观察到转录组效应水平 (NOTEL-5)，定义为差异表达基因少于 5 个的最高浓度。
5. IVIVE 与 PBK 建模： 通过反向剂量学将推导出的 tPODs 转化为外部剂量。研究使用了三种不同的鼠类 PBK 模型：美国环保署 (EPA) 的 httk R 包、欧洲食品安全局 (EFA) 的 TK-Plate 在线工具，以及巴斯夫 (BASF) 内部的 9 隔室 TK-Estimator。
6. 人类群体建模： 使用基于人类群体的 PBK 模型（使用 httk 包及 100,000 人的虚拟人群）从最敏感的 tPOD 推导出第 5 百分位口服等效剂量 (OED)。
7. 敏感性分析： 计算了关键输入参数（游离分数、logKow、内源性清除率和表观渗透性）的敏感性系数，以评估它们对血浆 $C_{max}$ 预测的影响。

主要结果

• 转录组敏感性： 两种细胞系和平台均检测到了浓度依赖性的基因表达变化。识别出的最敏感 tPOD 为 0.65 µM（通过 TempO-Seq 进行 HepG2 的 25th 基因 BMC），而 HepaRG RNA-seq 分析得到的最高敏感 tPOD 为 0.68 µM (NOTEL-5)。
• IVIVE 推导的 POD： 当转化为外部剂量时，IVIVE 推导的 PODs 通常落在 PDM 已报道的监管体内 POD 范围内。
  • 鼠类最敏感预测值为 6.0 mg/kg bw/day。
  • 基于人类群体的建模结果显示，第 5 百分位 OED 为 0.068 mg/kg bw/day。
• 与监管值的比较： 预测的人类 OED (0.068 mg/kg bw/day) 接近已确定的监管每日摄入量 (ADI) 0.125 mg/kg bw/day 以及可接受操作员暴露水平 (AOEL) 0.17 mg/kg bw/day。鼠类 POD (6.0 mg/kg bw/day) 与用于计算 ADI 的慢性犬类研究中得出的 NOAEL (12.5 mg/kg bw/day) 相符。
• 变异来源： 研究发现，由选择的毒代动力学模型 (PBK) 引入的变异程度，与由于不同转录组分析方法（细胞系、平台和统计方法）引起的变异程度相当。敏感性分析表明，吸收和分配参数（特别是 $P_{app}$ 和 logKow）是动力学预测中不确定性的主要驱动因素。
• 模型性能： PBK 模型预测的血浆 $C_{max}$ 值处于单次口服给药后测得的体内大鼠数据的 0.5 至 1.0 倍范围内，处于合格 PBPK 模型的可接受准确度范围内。

意义与主张
作者声称，本研究支持了将体外转录组学与 IVIVE 结合以估算农用化学品全身毒性阈值的可行性。结果表明，基于转录组学的 NAM 工作流可以提供与传统体内研究所得结果相当的保护性暴露水平估算值。

至关重要的是，本文强调，IVIVE 中的不确定性对最终预测的贡献至少与转录组数据分析的不确定性相当。这一发现强调，下一代风险评估 (NGRA) 工作流的改进，既取决于转录组学方法的完善，也同样取决于毒代动力学建模、剂量学和动力学参数化的进步。

研究结论认为，尽管该方法在识别保护性全身毒性阈值方面展现出潜力，但在建立常规监管应用之前，仍需对更广泛的农用化学品进行更广泛的评估，并进行进一步的方法学完善（包括使用实验测定的动力学参数和体外剂量学）。作者保持了审慎的态度，将此项工作呈现为一项概念验证性案例研究，而非当前监管框架的确定性替代方案。