How robust are transcriptomics-based points of departure when translated to in vivo doses by kinetic-modeling? A case study with the herbicide pendimethalin using HepG2 and HepaRG cells

Resumen Técnico: Robustez de los Puntos de Partida Basados en Transcriptómica para el Pendimetalina

Planteamiento del Problema
La evaluación de riesgos tradicional para agroquímicos depende en gran medida de estudios in vivo en animales para derivar Puntos de Partida (POD, por sus siglas en inglés) para valores de guía regulatoria. Si bien las Metodologías de Nuevos Enfoques (NAMs) ofrecen una vía para estimar niveles de exposición protectores sin necesidad de nuevos datos animales, su rendimiento predictivo y robustez requieren una validación frente a los resultados in vivo establecidos. Específicamente, existe la necesidad de evaluar si los flujos de trabajo basados en transcriptómica, combinados con el modelado de Cinética Basada en la Fisiología (PBK) para la extrapolación in vitro-a-in vivo (IVIVE), pueden generar umbrales de toxicidad sistémica biológicamente plausibles. Además, la contribución relativa de la incertidumbre proveniente del modelado toxicocinético frente al análisis de datos transcriptómicos sigue sin estar clara.

Metodología
Este estudio de caso utilizó pendimetalina (PDM), un agroquímico con amplios datos de referencia toxicológicos y cinéticos existentes, para evaluar un flujo de trabajo de NAM basado en transcriptómica. El estudio empleó dos modelos de células hepáticas y plataformas transcriptómicas distintas:

1. Modelos Celulares: HepG2 (carcinoma hepatocelular inmortalizado) y HepaRG (células madre hepáticas diferenciadas).
2. Plataformas de Transcriptómica: TempO-Seq dirigido en células HepG2 y secuenciación de ARN no dirigida en células HepaRG.
3. Exposición: Las células fueron expuestas a PDM durante 48 horas en rangos de concentración (0.07–202 µM para HepaRG; 0.8–56 µM para HepG2), seleccionados según los límites de citotoxicidad (IC25).
4. Derivación de tPOD: Los cambios en la expresión génica se analizaron mediante BMDExpress 3.0. Se aplicaron cuatro enfoques estadísticos para derivar los Puntos de Partida Transcriptómicos (tPODs):
   • Concentración de Referencia (BMC) del 25º gen.
   • Percentil 5 de la distribución de BMC.
   • 1er modo de la distribución de densidad de BMC.
   • Nivel de Efecto Transcriptómico No Observado (NOTEL-5), definido como la concentración más alta con menos de 5 genes expresados diferencialmente.
5. IVIVE y Modelado PBK: Los tPODs derivados se tradujeron a dosis externas mediante dosimetría inversa. Se utilizaron tres modelos de PBK de rata distintos: el paquete de R httk de la EPA, la herramienta en línea TK-Plate de la EFSA y un TK-Estimator interno de BASF de 9 compartimentos.
6. Modelado de Población Humana: Se utilizó un modelo PBK basado en la población humana (usando el paquete httk con una población virtual de 100,000 individuos) para derivar una Dosis Equivalente Oral (OED) del percentil 5 a partir del tPOD más sensible.
7. Análisis de Sensibilidad: Se calcularon coeficientes de sensibilidad para parámetros de entrada clave (fracción no unida, logKow, aclaramiento intrínseco y permeabilidad aparente) para evaluar su impacto en las predicciones de $C_{max}$ plasmática.

Resultos Clave

• Sensibilidad Transcriptómica: Ambas líneas celulares y plataformas detectaron cambios en la expresión génica dependientes de la concentración. El tPOD más sensible identificado fue de 0.65 µM (BMC del 25º gen en HepG2 vía TempO-Seq), mientras que el análisis de RNA-seq de HepaRG arrojó un tPOD más sensible de 0.68 µM (NOTEL-5).
• PODs Derivados de IVIVE: Cuando se tradujeron a dosis externas, los PODs derivados de IVIVE generalmente se situaron dentro del rango de los PODs in vivo regulatorios reportados para la PDM.
  • La predicción más sensible para la rata arrojó un POD de 6.0 mg/kg peso corporal/día.
  • El modelado de la población humana resultó en una OED del percentil 5 de 0.068 mg/kg peso corporal/día.
• Comparación con Valores Regulatorios: La OED humana predicha (0.068 mg/kg peso corporal/día) es cercana a la Ingesta Diaria Aceptable (ADI) establecida de 0.125 mg/kg peso corporal/día y al Nivel de Exposición Aceptable para el Operador (AOEL) de 0.17 mg/kg peso corporal/día. El POD de la rata (6.0 mg/kg peso corporal/día) se alinea con el NOAEL de 12.5 mg/kg peso corporal/día derivado de un estudio crónico en perros (utilizado para el ADI).
• Fuentes de Variabilidad: Se encontró que la variabilidad introducida por la elección del modelo toxicocinético (PBK) es de una magnitud similar a la variabilidad asociada con los diferentes enfoques de análisis transcriptómico (línea celular, plataforma y método estadístico). El análisis de sensibilidad indicó que los parámetros de absorción y partición (específicamente $P_{app}$ y logKow) fueron los principales impulsores de la incertidumbre en las predicciones cinéticas.
• Desempeño del Modelo: Los valores de $C_{max}$ plasmática predichos por los modelos PBK estuvieron dentro de un rango de 0.5 a 1.0 veces de los datos medidos in vivo en ratas tras una dosis oral única, situándose dentro del rango de precisión aceptable para modelos PBPK calificados.

Significado y Reivindicaciones
Los autores sostienen que este estudio respalda la viabilidad de combinar la transcriptómica in vitro con IVIVE para estimar los umbrales de toxicidad sistémica para agroquímicos. Los resultados sugieren que los flujos de trabajo de NAM basados en transcriptómica pueden proporcionar estimaciones de niveles de exposición protectores que son comparables a los derivados de los estudios tradicionales in vivo.

Crucialmente, el artículo destaca que la incertidumbre en el IVIVE contribuye al menos tanto a la predicción final como la incertidumbre en el análisis de datos transcriptómicos. Este hallazgo subraya que las mejoras en los flujos de trabajo de la Evaluación de Riesgos de Nueva Generación (NGRA) dependen tanto de los avances en el modelado toxicocinético, la dosimetría y la parametrización cinética como del refinamiento de las metodologías transcriptómicas.

El estudio concluye que, si bien el enfoque muestra potencial para identificar umbrales de toxicidad sistémica protectores, se requiere una evaluación más amplia en una gama más amplia de agroquímicos y un mayor refinamiento metodológico (incluyendo el uso de parámetros cinéticos determinados experimentalmente y dosimetría in vitro) antes de que se pueda establecer una aplicación regulatoria rutinaria. Los autores mantienen una postura modesta, presentando el trabajo como un estudio de caso de prueba de concepto en lugar de un reemplazo definitivo para los marcos regulatorios actuales.