How robust are transcriptomics-based points of departure when translated to in vivo doses by kinetic-modeling? A case study with the herbicide pendimethalin using HepG2 and HepaRG cells

Technische Samenvatting: Robuustheid van Transcriptomics-gebaseerde Points of Departure voor Pendimethalin

Probleemstelling
Traditionele risicobeoordeling voor agrochemicaliën leunt zwaar op in vivo dierstudies om Points of Departure (POD's) af te leiden voor regelgevende advieswaarden. Hoewel New Approach Methodologies (NAM's) een pad bieden om beschermende blootstellingsniveaus te schatten zonder nieuwe diergegevens, vereisen hun voorspellende prestaties en robuustheid validatie tegen gevestigde in vivo uitkomsten. Specifiek is er een behoefte om te evalueren of transcriptomics-gebaseerde workflows, wanneer gecombineerd met Physiologically-Based Kinetic (PBK) modellering voor in vitro-naar-in vivo extrapolatie (IVIVE), biologisch plausibele systemische toxiciteitsdrempels kunnen genereren. Bovendien blijft de relatieve bijdrage van onzekerheid vanuit toxicokinetische modellering versus transcriptomische data-analyse onduidelijk.

Methodologie
Deze casestudy maakte gebruik van pendimethalin (PDM), een agrochemical met uitgebreide bestaande toxicologische en kinetische referentiedata, om een transcriptomics-gebaseerde NAM-workflow te evalueren. De studie maakte gebruik van twee verschillende in vitro levermodellen en transcriptomics-platforms:

1. Celmodellen: HepG2 (geïmmortaliseerde hepatocellulaire carcinoomcellen) en HepaRG (gedifferentieerde hepatische stamcellen).
2. Transcriptomics-platforms: Gerichte TempO-Seq in HepG2-cellen en ongerichte RNA-sequencing in HepaRG-cellen.
3. Blootstelling: Cellen werden 48 uur lang blootgesteld aan PDM over concentratiebereiken (0,07–202 µM voor HepaRG; 0,8–56 µM voor HepG2), geselecteerd op basis van cytotoxiciteitslimieten (IC25).
4. tPOD-afleiding: Veranderingen in genexpressie werden geanalyseerd met BMDExpress 3.0. Vier statistische benaderingen werden toegepast om Transcriptomic Points of Departure (tPOD's) af te leiden:
   • 25ste gen Benchmark Concentratie (BMC).
   • 5de percentiel van de BMC-distributie.
   • 1ste modus van de BMC-dichtheidsdistributie.
   • No Observed Transcriptomic Effect Level (NOTEL-5), gedefinieerd als de hoogste concentratie met minder dan 5 differentieel tot expressie gebrachte genen.
5. IVIVE en PBK-modellering: Afgeleide tPOD's werden vertaald naar externe doses middels reverse dosimetry. Drie verschillende rat-PBK-modellen werden gebruikt: de httk R-package van de EPA, de TK-Plate online tool van de EFSA, en een interne 9-compartiment TK-Estimator van BASF.
6. Menselijke populatiemodellering: Een menselijke populatie-gebaseerde PBK-model (gebruikmakend van de httk package met een virtuele populatie van 100.000 individuen) werd gebruikt om een 5de-percentiel Oral Equivalent Dose (OED) af te leiden van de meest gevoelige tPOD.
7. Gevoeligheidsanalyse: Gevoeligheidscoëfficiënten werden berekend voor belangrijke inputparameters (fractie ongebonden, logKow, intrinsieke klaring en schijnbare permeabiliteit) om de impact op plasma $C_{max}$-voorspellingen te beoordelen.

Belangrijkste Resultaten

• Transcriptomische Sensitiviteit: Beide cellijnen en platforms detecteerden concentratieafhankelijke genexpressieveranderingen. De meest gevoelige tPOD die werd geïdentificeerd was 0,65 µM (25ste gen BMC in HepG2 via TempO-Seq), terwijl de HepaRG RNA-seq analyse een meest gevoelige tPOD van 0,68 µM opleverde (NOTEL-5).
• IVIVE-afgeleide POD's: Wanneer vertaald naar externe doses, vielen de IVIVE-afgeleide POD's over het algemeen binnen het bereik van de gereguleerde in vivo POD's gerapporteerd voor PDM.
  • De meest gevoelige voorspelling voor de rat leverde een POD op van 6,0 mg/kg bw/dag.
  • De menselijke populatie-gebaseerde modellering resulteerde in een 5de-percentiel OED van 0,068 mg/kg bw/dag.
• Vergelijking met Regelgevende Waarden: De voorspelde menselijke OED (0,068 mg/kg bw/dag) ligt dicht bij de vastgestelde wettelijke Acceptable Daily Intake (ADI) van 0,125 mg/kg bw/dag en de Acceptable Operator Exposure Level (AOEL) van 0,17 mg/kg bw/dag. De rat-POD (6,0 mg/kg bw/dag) komt overeen met de NOAEL van 12,5 mg/kg bw/dag afgeleid uit een chronische hondstudie (gebruikt voor de ADI).
• Bronnen van Variabiliteit: De variabiliteit geïntroduceerd door de keuze van het toxicokinetische model (PBK) bleek van een vergelijkbare grootteorde te zijn als de variabiliteit geassocieerd met verschillende transcriptomische analysebenaderingen (cellijn, platform en statistische methode). Gevoeligheidsanalyse gaf aan dat absorptie- en partitieparameters (specifiek $P_{app}$ en logKow) de primaire drijfveren waren van onzekerheid in de kinetische voorspellingen.
• Modelprestaties: Voorspelde plasma $C_{max}$-waarden van de PBK-modellen lagen binnen 0,5 tot 1,0-voud van de gemeten in vivo rat-data na een eenmalige orale dosis, wat binnen het acceptabele nauwkeurigheidsbereik valt voor gekwalificeerde PBPK-modellen.

Betekenis en Claims
De auteurs stellen dat deze studie de haalbaarheid ondersteunt van het combineren van in vitro transcriptomics met IVIVE om systemische toxiciteitsdrempels voor agrochemicaliën te schatten. De resultaten suggereren dat transcriptomics-gebaseerde NAM-workflows beschermende blootstellingsniveaus kunnen bieden die vergelijkbaar zijn met die afgeleid uit traditionele in vivo studies.

Cruciaal is dat het artikel benadrukt dat de onzekerheid in IVIVE minstens evenveel bijdraagt aan de uiteindelijke voorspelling als de onzekerheid in de transcriptomische data-analyse. Deze bevinding onderstreept dat verbeteringen in Next Generation Risk Assessment (NGRA) workflows evenzeer afhangen van vooruitgang in toxicokinetische modellering, dosimetrie en kinetische parametrisering als van de verfijning van transcriptomische methodologieën.

De studie concludeert dat hoewel de aanpak veelbelovend is voor het identificeren van beschermende systemische toxiciteitsdrempels, een bredere evaluatie over een breder scala aan agrochemicaliën en verdere methodologische verfijning (waaronder het gebruik van experimenteel bepaalde kinetische parameters en in vitro dosimetrie) vereist is voordat routineuze toepassing in de regelgeving kan worden vastgesteld. De auteurs behouden een bescheiden standpunt door het werk te presenteren als een proof-of-concept casestudy in plaats van een definitieve vervanging voor huidige regelgevende kaders.