How robust are transcriptomics-based points of departure when translated to in vivo doses by kinetic-modeling? A case study with the herbicide pendimethalin using HepG2 and HepaRG cells

技術要約：ペンディメタリンにおけるトランスクリプトミクスに基づく出発点（POD）の堅牢性

問題提起
農薬の従来のリスク評価は、規制上のガイダンス値の算出において、in vivo（生体内）動物実験に大きく依存している。新アプローチ法（NAMs）は、新たな動物実験データなしに保護的な曝露レベルを推定する経路を提供するが、その予測性能と堅牢性を検証するには、確立されたin vivoの結果に対する妥当性確認が必要である。具体的には、トランスクリプトミクス・ワークフローを生理学的薬物速度論（PBK）モデリングと組み合わせたin vitro-to-in vivo外挿（IVIVE）が、生物学的に妥当な全身毒性閾値を生成できるかどうかを評価する必要がある。さらに、毒性動態モデリングとトランスクリプトミクス・データ解析のそれぞれから生じる不確実性の相対的な寄与についても、依然として不明である。

方法論
本ケーススタディでは、広範な既存の毒性および動力学的な参照データを持つ農薬であるペンディメタリン（PDM）を用い、トランスクリプトミクスに基づくNAMワークフローの評価を行った。本研究では、2種類の異なるin vitro肝細胞モデルおよびトランスクリプトミクス・プラットフォームを採用した：

1. 細胞モデル： HepG2（不死化肝細胞癌）およびHepaRG（分化した肝前駆細胞）。
2. トランスクリプトミクス・プラットフォーム： HepG2細胞を用いた標的型TempO-Seq、およびHepaRG細胞を用いた非標的型RNAシーケンシング。
3. 曝露： 細胞をPDMに対して48時間曝露した（HepaRGでは0.07–202 µM、HepG2では0.8–56 µM）。濃度範囲は細胞毒性限界（IC25）に基づいて選択された。
4. tPODの導出： 遺伝子発現の変化をBMDExpress 3.0を用いて解析した。tPOD（トランスクリプトミクスに基づく出発点）を導出するために、以下の4つの統計的手法を適用した：
   • 25パーセンタイル遺伝子ベンチマーク濃度（BMC）。
   • BMC分布の5パーセンタイル。
   • BMC密度分布の第1モード。
   • 無観察トランスクリプトミクス影響レベル（NOTEL-5）：発現変動遺伝子が5個未満となる最高濃度と定義。
5. IVIVEおよびPBKモデリング： 導出されたtPODを逆用量計算（reverse dosimetry）により外部投与量へと変換した。3つの異なるラットPBKモデルを使用した：EPAのhttk Rパッケージ、EF社（EFSA）のTK-Plateオンラインツール、およびBASF社内部の9コンパートメント型TK-Estimatorである。
6. ヒト集団モデリング： ヒト集団ベースのPBKモデル（httkパッケージを使用し、10万人の仮想集団を用いた）を用い、最も感受性の高いtPODから5パーセンタイル経口等価線量（OED）を導出した。
7. 感度分析： 非結合分率、logKow、固有クリアランス、および見かけの透過性が血漿$C_{max}$予測に与える影響を評価するため、主要な入力パラメータに対する感度係数を算出した。

主な結果

• トランスクリプトミクスの感受性： 両方の細胞株およびプラットフォームにおいて、濃度依存的な遺伝子発現の変化が検出された。特定された最も感受性の高いtPODは、0.65 µM（TempO-Seqを用いたHepG2における25パーセンタイル遺伝子BMC）であった。一方、HepaRGのRNA-seq解析による最も敏感なtPODは、0.68 µM（NOTEL-5）であった。
• IVIVE由来のPOD： 外部投与量に変換された際、IVIVE由来のPODは、概してPDMに関して報告されている規制上のin vivo PODの範囲内に収まった。
  • ラットにおける最も敏感な予測値は、POD 6.0 mg/kg bw/dayであった。
  • ヒト集団ベースのモデリングによる5パーセンタイルOEDは、0.068 mg/kg bw/dayであった。
• 規制値との比較： 予測されたヒトOED（0.068 mg/kg bw/day）は、確立された規制上の一日許容量（ADI）である0.125 mg/kg bw/dayおよび、操作者曝露許容レベル（AOEL）である0.17 mg/kg bw/dayに近い値である。ラットのPOD（6.0 mg/kg bw/day）は、ADIの算出に使用された慢性犬試験から得られたNOAELの12.5 mg/kg bw/dayと一致している。
• 変動の要因： 毒性動態モデル（PBK）の選択によって導入される変動は、トランスクリプトミクス解析手法（細胞株、プラットフォーム、および統計手法）に関連する変動と同程度の大きさであることが判明した。感度分析の結果、吸収および分配パラメータ（具体的には$P_{app}$およびlogKow）が、動力学的な予測における不確実性の主要な要因であることが示された。
• モデルの性能： PBKモデルから予測された血漿$C_{max}$値は、単回経口投与後の実測されたin vivoラットデータに対して0.5〜1.0倍の範囲内にあり、適格化されたPBPKモデルの許容精度範囲内に収まっていた。

意義および主張
著者らは、本研究が、in vitroトランスクリプトミクスとIVIVEを組み合わせて、農薬の全身毒性閾値を推定することの実現可能性を支持していると主張している。結果は、トランスクリプトミクスに基づくNAMワークフローが、従来のin vivo研究から導出されるものと同等の、保護的な曝露レベルの推定を提供できる可能性を示唆している。

極めて重要な点として、本論文は、IVIVEにおける不確実性が、トランスクリプトミクス・データの解析による不確実性と少なくとも同等の寄与を最終的な予測に与えることを強調している。この知見は、次世代リスク評価（NGRA）ワークフローの改善には、トランスクリプトミクス手法の洗練だけでなく、毒性動態モデリング、用量設定、および動力学パラメータの設定といった側面における進展も同様に重要であることを浮き彫りにしている。

本研究は、このアプローチが保護的な全身毒性閾値を特定する上で有望であることを示しているものの、ルーチンな規制への適用を確立するためには、より広範な農薬を用いた広範な評価、および手法のさらなる洗練（実験的に決定された動力学パラメータやin vitro用量設定の活用を含む）が必要であると結論付けている。著者らは、本研究を決定的な規制枠組みの代替ではなく、概念実証のケーススタディとして提示するという控えめな立場を維持している。