How robust are transcriptomics-based points of departure when translated to in vivo doses by kinetic-modeling? A case study with the herbicide pendimethalin using HepG2 and HepaRG cells

Technisches Resümee: Robustheit von Transkriptomik-basierten Points of Departure für Pendimethalin

Problemstellung
Die traditionelle Risikobewertung von Agrochemikalien stützt sich stark auf In-vivo-Tierstudien, um Points of Departure (PODs) für regulatorische Richtwerte abzuleiten. Während New Approach Methodologies (NAMs) einen Weg zur Schätzung protektiver Expositionslevel ohne neue Tierdaten eröffnen, erfordern deren Vorhersageleistung und Robustheit eine Validierung gegenüber etablierten In-vivo-Ergebnissen. Insbesondere besteht die Notwendigkeit zu untersuchen, ob ein transkriptomik-basierter Workflow, in Kombination mit physiologisch-basierten kinetischen (PBK) Modellen für die In-vitro-zu-In-vivo-Extrapolation (IVIVE), biologisch plausible Schwellenwerte für die systemische Toxizität generieren kann. Darüber hinaus bleibt der relative Beitrag der Unsicherheit aus der toxikokinetischen Modellierung im Vergleich zur transkriptomischen Datenanalyse ungeklärt.

Methodik
Diese Fallstudie nutzte Pendimethalin (PDM), eine Agrochemikalie mit umfangreichen bestehenden toxikologischen und kinetischen Referenzdaten, um einen transkriptomik-basierten NAM-Workflow zu evaluieren. Die Studie verwendete zwei unterschiedliche In-vitro-Lebermodelle und transkriptomische Plattformen:

1. Zellmodelle: HepG2 (immortalisierte hepatozelluläre Karzinomzellen) und HepaRG (differenzierte hepatische Stammzellen).
2. Transkriptomische Plattformen: Targetierte TempO-Seq in HepG2-Zellen und ungerichtete RNA-Sequenzierung in HepaRG-Zellen.
3. Exposition: Zellen wurden 48 Stunden lang einer PDM-Exposition über Konzentrationsbereiche (0,07–202 µM für HepaRG; 0,8–56 µM für HepG2) ausgesetzt, die basierend auf Zytotoxizitätslimits (IC25) ausgewählt wurden.
4. tPOD-Ableitung: Änderungen der Genexpression wurden mittels BMDExpress 3.0 analysiert. Es wurden vier statistische Ansätze angewendet, um transkriptomische Points of Departure (tPODs) abzuleiten:
   • 25. Perzentil-Gen-Benchmark-Konzentration (BMC).
   • 5. Perzentil der BMC-Verteilung.
   • 1. Modus der BMC-Dichteverteilung.
   • No Observed Transcriptomic Effect Level (NOTEL-5), definiert als die höchste Konzentration mit weniger als 5 differenziell exprimierten Genen.
5. IVIVE und PBK-Modellierung: Abgeleitete tPODs wurden mittels Rückwärtsdosimetrie in externe Dosen übersetzt. Es wurden drei verschiedene Ratten-PBK-Modelle verwendet: das EPA httk R-Paket, das EFSA TK-Plate Online-Tool und ein BASF-internes 9-Kompartiment-TK-Estimator.
6. Humane Populationsmodellierung: Ein PBK-Modell auf Basis der menschlichen Population (unter Verwendung des httk-Pakets mit einer virtuellen Population von 100.000 Individuen) wurde verwendet, um eine 5. Perzentil-Oral-Äquivalenzdosis (OED) aus dem sensitivsten tPOD abzuleiten.
7. Sensitivitätsanalyse: Sensitivitätskoeffizienten wurden für Schlüsselparameter (freier Anteil, LogKow, intrinsische Clearance und scheinbare Permeabilität) berechnet, um deren Einfluss auf die Plasma-$C_{max}$-Vorhersagen zu bewerten.

Hauptergebnisse

• Transkriptomische Sensitivität: Sowohl die Zelllinien als auch die Plattformen detektierten konzentrationsabhängige Änderungen der Genexpression. Der sensitivste identifizierte tPOD war 0,65 µM (25. Perzentil-Gen-BMC in HepG2 via TempO-Seq), während die HepaRG RNA-Seq-Analyse einen sensitivsten tPOD von 0,68 µM (NOTEL-5) ergab.
• IVIVE-abgeleitete PODs: Wenn diese in externe Dosen übersetzt wurden, lagen die IVIVE-abgeleiteten PODs generell im Bereich der berichteten regulatorischen In-vivo-PODs für PDM.
  • Die sensitivste Vorhersage für die Ratte ergab einen POD von 6,0 mg/kg Körpergewicht/Tag.
  • Die populationsbasierte Modellierung am Menschen ergab eine 5. Perzentil-OED von 0,068 mg/kg Körpergewicht/Tag.
• Vergleich mit regulatorischen Werten: Die vorhergesagte humane OED (0,068 mg/kg Körpergewicht/Tag) liegt nahe am etablierten regulatorischen zulässigen täglichen Aufnahdewert (ADI) von 0,125 mg/kg Körpergewicht/Tag und dem zulässigen Aufenthaltswert für Anwender (AOEL) von 0,17 mg/kg Körpergewicht/Tag. Der Ratten-POD (6,0 mg/kg Körpergewicht/Tag) stimmt mit dem NOAEL von 12,5 mg/kg Körpergewicht/Tag überein, der aus einer chronischen Hundestudie (die dem ADI zugrunde liegt) abgeleitet wurde.
• Quellen der Variabilität: Die durch die Wahl des toxikokinetischen Modells (PBK) eingeführte Variabilität erwies sich als vergleichbar mit der Variabilität, die durch unterschiedliche transkriptomische Analyseansätze (Zelllinie, Plattform und statistische Methode) verursacht wurde. Die Sensitivitätsanalyse zeigte, dass Absorptions- und Partitionierungsparameter (insbesondere $P_{app}$ und LogKow) die primären Treiber der Unsicherheit in den kinetischen Vorhersagen waren.
• Modellleistung: Die vorhergesagten Plasma-$C_{max}$-Werte der PBK-Modelle lagen innerhalb des Bereichs von 0,5 bis 1,0-fach der gemessenen In-vivo-Rattendaten nach einer einmaligen oraler Gabe, was innerhalb des akzeptablen Genauigkeitsbereichs für qualifizierte PBPK-Modelle liegt.

Bedeutung und Behauptungen
Die Autoren behaupten, dass diese Studie die Machbarkeit unterstützt, die Kombination von In-vitro-Transkriptomik mit IVIVE zur Schätzung systemischer Toxizitätsschwellen für Agrochemikalien. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass transkriptomik-basierte NAM-Workflows in der Lage sind, Schätzungen protektiver Expositionslevel zu liefern, die mit denen aus traditionellen In-vivo-Studien vergleichbar sind.

Entscheidend ist, dass die Studie hervorhebt, dass die Unsicherheit in der IVIVE mindestens ebenso stark zur endgültigen Vorhersage beiträgt wie die Unsicherheit in der transkriptomischen Datenanalyse. Dieser Befund unterstreicht, dass Verbesserungen in Next Generation Risk Assessment (NGRA)-Workflows gleichermaßen von Fortschritten in der toxikokinetischen Modellierung, Dosimetrie und kinetischen Parametrisierung abhängen wie von der Verfeinerung transkriptomischer Methodiken.

Die Studie kommt zu dem Schluss, dass dieser Ansatz zwar vielversprechend ist, um protektive systemische Toxizitätsschwellen zu identifizieren, jedoch eine breitere Evaluierung über ein größeres Spektrum an Agrochemikalien sowie weitere methodische Verfeinerungen (einschließlich der Verwendung experimentell bestimmter kinetischer Parameter und der In-vitro-Dosimetrie) erforderlich sind, bevor eine routinemäßige regulatorische Anwendung etabliert werden kann. Die Autoren vertreten eine moderate Position und präsentieren die Arbeit als Proof-of-Concept-Fallstudie statt als definitiven Ersatz für aktuelle regulatorische Rahmenbedingungen.