How robust are transcriptomics-based points of departure when translated to in vivo doses by kinetic-modeling? A case study with the herbicide pendimethalin using HepG2 and HepaRG cells

तकनीकी सारांश: पेंडिमेथालिन (Pendimethalin) के लिए ट्रांसक्रिप्टोमिक्स-आधारित पॉइंट्स ऑफ डेविएशन (POD) की मजबूती

समस्या विवरण
कृषि रसायनों के पारंपरिक जोखिम मूल्यांकन के लिए नियामक मार्गदर्शन मूल्यों (regulatory guidance values) को प्राप्त करने हेतु मुख्य रूप से इन विवो (in vivo) पशु अध्ययनों पर निर्भरता होती है। जबकि न्यू अप्रोच मेथोडोलॉजी (NAMs) नए पशु डेटा के बिना सुरक्षात्मक जोखिम स्तरों का अनुमान लगाने के लिए एक मार्ग प्रदान करती है, उनकी भविष्य कहने वाली क्षमता और मजबूती के लिए स्थापित इन विवो परिणामों के विरुद्ध सत्यापन की आवश्यकता होती है। विशेष रूप से, इस बात का मूल्यांकन करने की आवश्यकता है कि क्या ट्रांसक्रिप्टोमिक्स-आधारित वर्कफ़्लो, जब फिजियोलॉजिकल-बेस्ड काइनेटिक (PBK) मॉडलिंग के साथ इन विट्रो-टू-इन विवो एक्सट्रपोलेशन (IVIVE) के लिए संयोजित होता है, तो जैविक रूप से तर्कसंगत प्रणालीगत विषाक्तता सीमाएं (systemic toxicity thresholds) उत्पन्न कर सकता है। इसके अलावा, टॉक्सिकोकाइनेटिक मॉडलिंग बनाम ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा विश्लेषण से उत्पन्न अनिश्चितता का सापेक्ष योगदान स्पष्ट नहीं है।

कार्यप्रणाली
इस केस स्टडी में पेंडिमेथालिन (PDM), जो एक व्यापक मौजूदा विष विज्ञान और काइनेटिक संदर्भ डेटा वाला कृषि रसायन है, का उपयोग एक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स-आधारित NAM वर्कफ़्लो के मूल्यांकन के लिए किया गया। अध्ययन में दो अलग-अलग इन विट्रो लिवर मॉडल और ट्रांसक्रिप्टोमिक प्लेटफॉर्म का उपयोग किया गया:

1. सेल मॉडल: HepG2 (इमोर्टलाइज्ड हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा) और HepaRG (डिफरेंशिएटेड हेपेटिक स्टेम सेल्स)।
2. ट्रांसक्रिप्टोमिक्स प्लेटफॉर्म: HepG2 कोशिकाओं में लक्षित (Targeted) TempO-Seq और HepaRG कोशिकाओं में अनटारगेटेड (Untargeted) RNA सीक्वेंसिंग।
3. एक्सपोज़र: कोशिकाओं को PDM के लिए 48 घंटों तक सांद्रता श्रेणियों (HepaRG के लिए 0.07–202 µM; HepG2 के लिए 0.8–56 µM) में एक्सपोज़ किया गया, जिन्हें साइटोटॉक्सिसिटी सीमाओं (IC25) के आधार पर चुना गया था।
4. tPOD व्युत्पत्ति: जीन अभिव्यक्ति परिवर्तनों का विश्लेषण BMDExpress 3.0 का उपयोग करके किया गया। tPODs (ट्रांसक्रिप्टोमिक पॉइंट्स ऑफ डेविएशन) प्राप्त करने के लिए चार सांख्यिकीय दृष्टिकोण लागू किए गए:
   • 25वें जीन बेंचमार्क कंसंट्रेशन (BMC) का 25वां जीन BMC।
   • BMC वितरण का 5वां पर्सेंटाइल।
   • BMC डेंसिटी डिस्ट्रीब्यूशन का 1ला मोड।
   • नो ऑब्जर्व्ड ट्रांसक्रिप्टोमिक इफेक्ट लेवल (NOTEL-5), जिसे 5 से कम विभेदित जीन वाली उच्चतम सांद्रता के रूप में परिभाषित किया गया है।
5. IVIVE और PBK मॉडलिंग: व्युत्पन्न tPODs को रिवर्स डोसिमेट्री का उपयोग करके बाहरी खुराक में अनुवादित किया गया। तीन अलग-अलग रैट (rat) PBK मॉडल का उपयोग किया गया: EPA का httk R पैकेज, EFSA का TK-Plate ऑनलाइन टूल, और BASF-आंतरिक 9-कंपार्टमेंट TK-Estimator।
6. मानव जनसंख्या मॉडलिंग: सबसे संवेदनशील tPOD से 5वें-पर्सेंटाइल ओरल इक्विवेलेंट डोज (OED) प्राप्त करने के लिए एक मानव जनसंख्या-आधारित PBK मॉडल (एक वर्चुअल जनसंख्या के 100,000 व्यक्तियों के साथ httk पैकेज का उपयोग करके) का उपयोग किया गया।
7. संवेदनशीलता विश्लेषण (Sensitivity Analysis): प्रमुख इनपुट मापदंडों (फ्रेक्शन अनबाउंड, logKow, इंट्रिन्सिक क्लीयरेंस, और अपैरेंट परमिएबिलिटी) के लिए संवेदनशीलता गुणांकों की गणना की गई ताकि प्लाज्मा $C_{max}$ भविष्यवाणियों पर उनके प्रभाव का आकलन किया जा सके।

मुख्य परिणाम

• ट्रांसक्रिप्टोमिक संवेदनशीलता: दोनों सेल लाइनों और प्लेटफॉर्मों ने सांद्रता-निर्भर जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन का पता लगाया। पहचाना गया सबसे संवेदनशील tPOD 0.65 µM (HepG2 में TempO-Seq के माध्यम से 25वां जीन BMC) था, जबकि HepaRG RNA-seq विश्लेषण ने 0.68 µM का सबसे संवेदनशील tPOD दिया (NOTEL-5)।
• IVIVE-व्युत्पन्न PODs: जब बाहरी खुराकों में अनुवादित किया गया, तो IVIVE-व्युत्पन्न PODs आम तौर पर PDM के लिए रिपोर्ट किए गए नियामक इन विवो PODs की सीमा के भीतर आए।
  • रैट के लिए सबसे संवेदनशील भविष्यवाणी 6.0 mg/kg bw/day का POD प्रदान करती है।
  • मानव जनसंख्या-आधारित मॉडलिंग के परिणामस्वरूप सबसे संवेदनशील tPOD का 5वां-पर्सेंटाइल OED 0.068 mg/kg bw/day निकला।
• नियामक मूल्यों के साथ तुलना: अनुमानित मानव OED (0.068 mg/kg bw/day) PDM के स्थापित नियामक स्वीकार्य दैनिक सेवन (ADI) 0.125 mg/kg bw/day और स्वीकार्य ऑपरेटर एक्सपोजर लेवल (AOEL) 0.17 mg/kg bw/day के करीब है। रैट POD (6.0 mg/kg bw/day) deog (डॉग) के क्रोनिक अध्ययन से प्राप्त 12.5 mg/kg bw/day के NOAEL के अनुरूप है (जिसका उपयोग ADI के लिए किया गया था)।
• परिवर्तनीयता के स्रोत: यह पाया गया कि टॉक्सिकोकाइनेटिक मॉडल (PBK) के चयन से होने वाली परिवर्तनशीलता, ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा विश्लेषण (सेल लाइन, प्लेटफॉर्म और सांख्यिकीय विधि) से जुड़ी परिवर्तनशीलता के समान परिमाण की थी। संवेदनशीलता विश्लेषण ने संकेत दिया कि अवशोषण और विभाजन पैरामीटर (विशेष रूप से $P_{app}$ और logKow) काइनेटिक भविष्यवाणियों में अनिश्चितता के प्राथमिक चालक थे।
• मॉडल प्रदर्शन: PBK मॉडल से अनुमानित प्लाज्मा $C_{max}$ मान, एकल मौखिक खुराक के बाद मापे गए इन विवो रैट डेटा के 0.5 से 1.0-गुना के भीतर थे, जो योग्य PBPK मॉडलों के लिए स्वीकार्य सटीकता सीमा के भीतर आते हैं।

महत्व और दावे
लेखक दावा करते हैं कि यह अध्ययन कृषि रसायनों के लिए प्रणालीगत विषाक्तता सीमा का अनुमान लगाने के लिए इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टोमिक्स को IVIVE के साथ संयोजित करने की व्यवहार्यता का समर्थन करता है। परिणाम बताते हैं कि ट्रांसक्रिप्टोमिक्स-आधारित NAM वर्कफ़्लो सुरक्षात्मक जोखिम स्तरों के अनुमान प्रदान कर सकते हैं जो पारंपरिक इन विवो अध्ययनों से प्राप्त अनुमानों के तुलनीय हैं।

महत्वपूर्ण रूप से, यह पेपर इस बात पर प्रकाश डालता है कि IVIVE में अनिश्चितता, ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा विश्लेषण में अनिश्चितता के कम से कम बराबर योगदान देती है। यह निष्कर्ष कि नेक्स्ट जनरेशन रिस्क असेसमेंट (NGRA) वर्कफ़्लो में सुधार के लिए ट्रांसक्रिप्टोमिक पद्धतियों के परिशोधन के साथ-साथ टॉक्सिकोकाइनेटिक मॉडलिंग, डोसिमेट्री और काइनेटिक पैरामीट्राइजेशन में प्रगति भी उतनी ही आवश्यक है।

अध्ययन यह निष्कर्ष निकालता है कि हालांकि यह दृष्टिकोण सुरक्षात्मक प्रणालीगत विषाक्तता सीमा की पहचान करने के लिए आशाजनक है, लेकिन नियमित नियामक अनुप्रयोग स्थापित करने से पहले व्यापक मूल्यांकन (विभिन्न कृषि रसायनों के माध्यम से) और आगे के पद्धतिगत परिशोधन (प्रायोगिक रूप से निर्धारित काइनेटिक मापदंडों और इन विट्रो डोसिमेट्री सहित) की आवश्यकता है। लेखक एक मध्यम रुख बनाए रखते हैं, इस कार्य को वर्तमान नियामक ढांचे के निश्चित प्रतिस्थापन के बजाय एक प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट केस स्टडी के रूप में प्रस्तुत करते हैं।