How robust are transcriptomics-based points of departure when translated to in vivo doses by kinetic-modeling? A case study with the herbicide pendimethalin using HepG2 and HepaRG cells

기술 요약: 펜디메탈린(Pendimethalin)에 대한 전사체 기반 출발점(Points of Departure)의 견고성

문제 제기
농약에 대한 전통적인 위해성 평가는 규제 지침 값을 도출하기 위해 in vivo 동물 연구에 크게 의존한다. 신규 접근법(New Approach Methodologies, NAMs)은 새로운 동물 실험 데이터 없이도 보호 가능한 노출 수준을 추정할 수 있는 경로를 제공하지만, 이들의 예측 성능과 견고성을 입증하기 위해서는 기성 in vivo 결과와의 검증이 필요하다. 구체적으로, 전사체 기반 워크플로우가 생리적 기반 약동학(Physiologically-Based Kinetic, PBK) 모델링과 결합된 in vitro-to-in vivo 외삽(IVIVE)을 통해 생물학적으로 타당한 전신 독성 임계값을 생성할 수 있는지 평가할 필요가 있다. 또한, 독성동태 모델링과 전사체 데이터 분석에서 발생하는 불확실성의 상대적 기여도가 명확하지 않다.

방법론
본 사례 연구는 펜디메탈린(PDM, 광범위한 기존 독성 및 동태 참조 데이터를 보유한 농약)을 사용하여 전사체 기반 NAM 워크플로우를 평가하였다. 연구에서는 두 가지 서로 다른 in vitro 간 세포 모델과 전사체 플랫폼을 사용하였다:

1. 세포 모델: HepG2 (불멸화된 간세포암) 및 HepaRG (분화된 간 줄기세포).
2. 전사체 플랫폼: HepG2 세포에서의 표적형 TempO-Seq 및 HepaRG 세포에서의 비표적 RNA 시퀀싱.
3. 노출: 세포를 독성 한계(IC25)를 기준으로 선택된 0.07–202 µM(HepaRG) 및 0.8–56 µM(HepG2) 농도 범위에서 48시간 동안 PDM에 노출시켰다.
4. tPOD 도출: 유전자 발현 변화는 BMDExpress 3.0을 사용하여 분석되었다. 네 가지 통계적 접근법이 tPOD(전사체 출발점)를 도출하기 위해 적용되었다:
   • 25번째 유전자 벤치마크 농도(BMC).
   • BMC 분포의 5번째 백분위수.
   • BMC 밀도 분포의 1차 모드(1st mode).
   • 무해한 전사체 효과 수준(NOTEL-5): 차별적으로 발현된 유전자가 5개 미만인 최고 농도로 정의됨.
5. IVIVE 및 PBK 모델링: 역용량법(reverse dosimetry)을 통해 도출된 tPOD를 외부 용량으로 변환하였다. 세 가지 서로 다른 쥐(rat) PBK 모델이 활용되었다: EPA의 httk R 패키지, EFSA의 TK-Plate 온라인 도구, 그리고 BASF 내부의 9-구획 TK-Estimator.
6. 인구 집단 모델링: 가장 민감한 tPOD를 기반으로 5번째 백분위수 경구 등가 용량(OED)을 도출하기 위해 인구 집단 기반 PBK 모델(httk 패키지를 사용하며 100,000명의 가상 인구 포함)을 사용하였다.
7. 민감도 분석: 혈장 $C_{max}$ 예측에 미치는 영향을 평가하기 위해 주요 입력 파라미터(유리 분율, logKow, 내재적 클리어런스, 겉보기 투과도)에 대한 민감도 계수를 계산하였다.

주요 결과

• 전사체의 민감도: 두 세포주와 플랫폼 모두 농도 의존적인 유전자 발현 변화를 감지하였다. 가장 민감한 tPOD는 0.65 µM(TempO-Seq를 통한 HepG2의 25번째 유전자 BMC)였으며, HepaRG RNA-seq 분석은 0.68 µM(NOTEL-5)의 가장 민감한 tPOD를 나타냈다.
• IVIVE 유도 POD: 외부 용량으로 변환되었을 때, IVIVE 유도 POD는 일반적으로 PDM에 대해 보고된 규제적 in vivo POD 범위 내에 있었다.
  • 쥐에 대한 가장 민감한 예측값은 6.0 mg/kg bw/day의 POD를 나타냈다.
  • 인간 인구 기반 모델링 결과, 5번째 백분위수 OED는 0.068 mg/kg bw/day로 나타났다.
• 규제 값과의 비교: 예측된 인간 OED(0.068 mg/kg bw/day)는 기설정된 규제적 일일 섭취 허용량(ADI)인 0.125 mg/kg bw/day 및 허용 작업자 노출 수준(AOEL)인 0.17 mg/kg bw/day에 근접하다. 쥐의 POD(6.0 mg/kg bw/day)는 ADI 산출에 사용된 만성 개(dog) 연구에서 도출된 NOAEL인 12.5 mg/kg bw/day와 일치한다.
• 변동성의 원인: 독성동태 모델(PBK)의 선택에 따른 변동성은 전사체 분석 접근 방식(세포주, 플랫폼 및 통계 방법)과 관련된 변동성과 유사한 규모인 것으로 나타났다. 민감도 분석 결과, 흡수 및 분배 파라미터(특히 $P_{app}$ 및 logKow)가 동태 예측의 불확실성을 유발하는 주요 동인임을 확인하였다.
• 모델 성능: PBK 모델로부터 예측된 혈장 $C_{max}$ 값은 단회 경구 투여 후 측정된 in vivo 쥐 데이터의 0.5~1.0배 범위 내에 있었으며, 이는 자격을 갖춘 PBPK 모델의 허용 정확도 범위 내에 해당한다.

의의 및 주장
저자들은 본 연구가 in vitro 전사체와 IVIVE를 결합하여 농약의 전신 독성 임계값을 추정하는 것의 타당성을 뒷받침한다고 주장한다. 결과는 전사체 기반 NAM 워크플로우가 전통적인 in vivo 연구로부터 도출된 것과 유사한 보호적 노출 수준을 제공할 수 있음을 시사한다.

결정적으로, 본 논문은 IVIVE의 불확실성이 전사체 데이터 분석의 불확실성만큼이나 최종 예측에 기여한다는 점을 강조한다. 이러한 발견은 차세대 위해성 평가(NGRA) 워크플ow의 발전이 전사체 방법론의 개선뿐만 아니라 독성동태 모델링, 용량 측정 및 동태 파라미터화의 발전에도 달려 있음을 보여준다.

본 연구는 이 접근법이 보호적인 전신 독성 임계값을 식별하는 데 유망함을 보여주지만, 루틴한 규제 적용을 확립하기 전에는 더 넓은 범위의 농약에 대한 광범위한 평가와 추가적인 방법론적 개선(실험적으로 결정된 동태 파라미터 및 in vitro 용량 측정 포함)이 필요하다고 결론짓는다. 저자들은 이 작업을 현재의 규제 체계를 대체하는 확정적인 교체가 아닌, 개념 증명(proof-of-concept) 사례 연구로서 제시하며 신중한 입장을 유지하고 있다.