Rigidified and modular wireframe DNA nanotubes as nanorulers to validate super resolution imaging techniques

لرؤية العالم غير المرئي داخل الخلية الحية، طور العلماء مجاهر يمكنها رصد التفاصيل الأصغر بكثير من الطول الموجي للضوء. تعمل تقنيات فائقة الدقة هذه عن طريق تشغيل وإيقاف الجزيئات الفلورية الفردية، والتقاط مواقعها واحداً تلو الآخر، ثم دمجها معاً لتكوين صورة حادة. ومع ذلك، لكي يثق الباحثون في هذه الصور، يحتاجون إلى مسطرة قياسية للتحقق مما إذا كانت أدواتهم تقيس بشكل صحيح. تماماً كما يحتاج النجار إلى حافة مستقيمة للتحقق من قطع المنشار، يحتاج العالم إلى هيكل ذي شكل معروف ودقيق لاختبار ما إذا كان المجهر يرى الحقيقة. لسنوات، كان إنشاء مثل هذه المسطرة أمراً صعباً لأن المواد المستخدمة كانت إما مرنة للغاية، أو صعبة البناء، أو معقدة للغاية في وضع العلامات عليها بشكل متسق.

قام فريق من الباحثين في جامعة مكغيل والمختبر الأوروبي للبيولوجيا الجزيئية الآن بابتكار نوع جديد من المساطر مصنوع بالكامل من الحمض النووي (DNA). لقد صمموا أنبوباً مجوفاً صلباً يتكون من أربعة أو خمسة خيوط قصيرة فقط من الحمض النووي. هذا الهيكل، الذي يسمونه أنبوب نانو من الهيكل السلكي، صُمم ليكون شديد الصلابة ومتماثل الشكل تماماً. ومن خلال تجميع هذه الأنابيب وأجزائها الصغيرة الفردية، أنتج الفريق أداة يمكنها التحقق من دقة أكثر أنظمة التصوير تقدماً، بما في ذلك تقنية متطورة تسمى MINFLUX. يوضح عملهم أن أنابيب الحمض النووي هذه ليست سهلة الصنع فحسب، بل إنها تحافظ على شكلها بدقة تجعلها قادرة على قياس مسافات تصل إلى سبعة نانومترات، مما يوفر معياراً موثوقاً لمستقبل التصوير بمقياس النانو.

التحدي في هذا المجال هو أن العديد من المعايير الموجودة معيبة. فبعضها مصنوع من بروتينات يمكن أن تلتوي، بينما بُني بعضها الآخر باستخدام طرق معقدة تجعلها باهظة الثمن وصعبة التكرار. إذا انحنت المسطرة أو إذا كانت العلامات المتصلة بها فضفاضة، فستكون القياسات التي يأخذها المجهر خاطئة. أراد الباحثون حل ذلك من خلال إنشاء هيكل بسيط التجميع، شديد الصلابة، وسهل وضع العلامات عليه. لقد لجأوا إلى تصميم يُعرف باسم الأنبوب النانوي ذي الهيكل السيدي. تخيل سقالة مصنوعة من أعمدة رفيعة؛ في هذه الحالة، الأعمدة هي خيوط من الحمض النووي. استخدم الفريق نمطاً محدداً حيث تتقاطع هذه الخيوط مع بعضها البعض لتشكيل أنبوب مجوف قوي. لقد بنوا نسخاً ذات مقاطع عرضية مثلثية، ومربعة، وخماسية، وكلها مصنوعة من نفس المجموعة الصغيرة من قطع الحمض النووي.

لجعل هذه الأنابيب مفيدة للتصوير، قام الباحثون بتثبيت مواقع إرساء صغيرة على طول جوانب الأنبوب. تعمل هذه المواقع كممرات هبوط لخيوط حمض نووي فلورية قصيرة تطفو في السائل المحيط بالعينة. عندما يهبط خيط فلوري على موقع إرساء، فإنه يتوهج لفترة وجيزة قبل أن يبتعد، مما يسمح للمجهر بتسجيل موقعه الدقيق. ولأن مواقع الإرساء مبنية مباشرة في خيوط الحمض النووي التي تشكل الأنبوب، فإن العلامات الفلورية تستقر تماماً حيث ينبغي لها أن تكون، دون وجود أي وصلات فضفاضة قد تفسد القياس. كما أضاف الفريق علامة لاصقة إلى أحد طرفي الأنبوب ليتصل بقوة بشريحة زجاجية، مما يضمن بقاء الهيكل ثابتاً أثناء عملية التصوير.

كان الاختبار الأول هو معرفة ما إذا كانت الأنابيب صلبة بما يكفي لتكون مسطرة. استخدم الباحثون تقنية فائقة الدقة قياسية لرسم خرائط لمواقع العلامات الفلورية على طول الأنابيب. ووجدوا أن الأنابيب كانت مستقيمة بشكل ملحوظ، حيث قاومت الميل الطبيعي للحمض النووي للانحناء والالتواء. ومن خلال تحليل شكل مئات من هذه الأنابيب، حسبوا مقياس الصلابة المعروف باسم "طول الاستمرارية"، والذي بلغ حوالي 1.6 ميكرومتر. وهذا يعني أن الأنابيب أكثر صلابة بحوالي ثلاثين إلى أربعين مرة من لولب الحمض النووي مزدوج السلسلة القياسي، مما يجعلها من بين أكثر هياكل الحمض النووي صلابة تم تسجيلها على الإطلاق. أكدت هذه الصلابة أن الأنابيب لن تتشوه تحت ضغط المجهر، مما يوفر مرجعاً مستقراً للقياسات.

بعد ذلك، دفع الفريق التكنولوجيا إلى أبعد من ذلك باستخدام طريقة تصوير أكثر قوة تسمى DNA-PAINT MINFLUX. تستخدم هذه التقنية شعاع ليزر على شكل حلقة (دونات) لتحديد موقع جزيء واحد بدقة متناهية، باستخدام عدد أقل بك la من جسيمات الضوء مقارنة بالطرق التقليدية. وعندما صوروا أنابيب الحمض النووي بهذا النظام، كانت النتائج مذهلة. استطاع المجهر تمييز الأجزاء الفردية، أو "الدرجات"، التي تشكل الأنبوب بوضوح. وقاس الباحثون المسافة بين هذه الدرجات ووجدوا أنها متباعدة بمسافة 13 إلى 14 نانومتر، وهي قيمة تطابق التصميم النظري والقياسات السابقة التي أجريت باستخدام المجاهر الإلكترونية. أكد هذا أن الأنابيب ليست صلبة فحسب، بل تم تجميعها أيضاً بدقة هندسية مثالية.

كما بحثت الدراسة في الأجزاء الفردية من الأنبوب، المعروفة بالدرجات، والتي يمكن عزلها وتصويرها بشكل منفصل. وفرت هذه القطع الأصغر فرصة لاختبار قدرة المجهر على قياس مسافات أقصر. ووجد الباحثون أنه ضمن درجة واحدة، كانت العلامات الفلورية متباعدة بمسافة 7 إلى 8 نانومترات تقريباً. وفي كثير من الحالات، استطاع المجهر تمييز هذه الفجوات الصغيرة بشكل مثالي، بما يطابق التصميم المقصود. ومع ذلك، لاحظوا أيضاً أنه في بعض الأحيان بدت العلامات مشوهة أو مفقودة. ومن خلال تحليل البيانات بعناية، حددوا أن هذه الأخطاء لم تكن بسبب خلل في هيكل الحمض النووي نفسه، بل كانت العلامات المفقودة ناتجة على الأرجح عن السطح الذي اتصل به الأنبوب، أو بسبب الضوء المكثف للمجهر الذي أتلف مواقع الإرساء بمرور الوقت. كان هذا التمييز حاسماً، لأنه أثبت أن مسطرة الحمض النووي نفسها كانت سليمة، وأن أي أخطاء كانت تأتي من الظروف التجريبية.

خلص الباحثون إلى أن أنابيب الحمض النووي النانوية ذات الهيكل السلكي هي أداة متعددة الاستخدامات وقوية لمعايرة المجاهر فائقة الدقة. فهي سهلة البناء، وتتطلب فقط عملية تسخين وتبريد بسيطة لتجميع الخيوط. كما أنها متوافقة مع أنواع مختلفة من الأصباغ الفلورية ويمكن تصويرها باستخدام إعدادات مجهرية متنوعة. والأهم من ذلك، أنها توفر معياراً موثوقاً وصلباً يمكنه قياس المسافات عبر مستويين مختلفين: التباعد بين 13 إلى 14 نانومتر بين أجزاء الأنبوب، والتباعد بين 7 إلى 8 نانومتر داخل جزء واحد. ومن خلال تقديم مرجع بسيط وقابل للتكرار وعالي الدقة، تسمح هذه الأنابيب للعلماء بالوثوق في صورهم أكثر من أي وقت مضى، مما يضمن أن التفاصيل الصغيرة التي يرونها في العالم البيولوجي هي حقيقية.