Rigidified and modular wireframe DNA nanotubes as nanorulers to validate super resolution imaging techniques

为了观察活细胞内部的微观世界，科学家们开发出了能够分辨远小于光波长细节的显微镜。这些超分辨率技术通过开启和关闭单个荧光分子，逐一捕捉它们的位置，然后将它们拼接成一张清晰的图像。然而，为了信任这些图像，研究人员需要一把标准的尺子来检查他们的仪器是否测量正确。正如木匠需要一把直尺来验证锯子的切割是否精准一样，科学家也需要一个已知且精确形状的结构来测试显微镜看到的是否是事实。多年来，制造这样一把尺子一直很困难，因为所使用的材料要么太软易变形，要么构建难度太大，或者标记方式过于复杂且难以保持一致。

来自麦吉尔大学和欧洲分子生物学实验室的一个研究小组，现在创造了一种完全由 DNA 制成的新型尺子。他们设计了一个由仅四到五条短 DNA 链构成的刚性中空管。这个被称为“线框 DNA 纳米管”（wireframe DNA nanotube）的结构，被设计得异常坚硬且具有完美的对称性。通过组装这些纳米管及其更小的单个片段，该团队生产出一种工具，可以验证包括尖端技术 MINFLUX 在内的最先进成像系统的准确性。他们的工作证明，这些 DNA 管不仅易于制作，而且其形状保持得如此精确，以至于可以测量低至 7 纳米的距离，为未来的纳米级成像提供了一个可靠的基准。

该领域的挑战在于许多现有的标准存在缺陷。有些是由可能发生形变的蛋白质制成的，而另一些则是使用复杂的方法构建的，这使得它们既昂贵又难以复制。如果尺子弯曲了，或者附着在上面的标签松动了，显微镜所做的测量就会出错。研究人员希望通过创造一种组装简单、极其刚硬且易于标记的结构来解决这个问题。他们转向了一种被称为“线框纳米管”的设计。想象一个由细杆组成的支架；在这种情况下，这些杆就是 DNA 链。该团队使用了一种特定的模式，让这些链相互交叉，从而形成一个坚固的中空管。他们构建了具有三角形、正方形和五边形横截面的版本，所有的版本都由同一组较小的 DNA 片段组成。

为了使这些纳米管在成像中发挥作用，研究人员沿管壁安装了微小的对接位点。这些位点就像是浮在样品周围液体中的短荧光 DNA 链的“着陆平台”。当一条荧光链落在对接位点上时，它会在飘走之前短暂地发光，从而让显微镜记录下它的精确位置。由于对接位点是直接构建在构成管子的 DNA 链之中的，因此荧光标记物会精确地位于它们应该在的位置，而不会有任何可能导致测量偏差的松动连接件。团队还在管的一端添加了一个粘性标签，使其能牢固地附着在玻璃载玻片上，确保结构在成像过程中保持静止。

第一个测试是观察这些管子是否足够坚硬，足以作为一把尺子。研究人员使用了一种标准的超分辨率技术来绘制沿管长度方向荧光标记器的位置。他们发现，这些纳米管非常笔直，能够抵抗 DNA 产生弯曲和扭转的自然倾向。通过分析数百个此类纳米管的形状，他们计算出了一个被称为“持久长度”（persistence length）的刚性度量值，结果约为 1.6 微米。这意味着这些管子的刚性大约是标准双螺旋 DNA 的三十到四十倍，是目前报道过的最刚性的 DNA 结构之一。这种刚性证实了这些管子不会在显微镜的压力下发生变形，从而为测量提供了稳定的参考。

随后，团队利用一种更强大的成像方法——DNA-PAINT MINFLUX 技术，进一步推进了这项技术。这种技术使用形状如“甜甜圈”的激光束来极高精度地定位单个分子的位置，且比传统方法消耗更少的光粒子。当他们使用该系统对 DNA 纳米管进行成像时，结果令人瞩目。显微镜可以清晰地分辨出构成管子的单个片段（或称“横档”）。研究人员测量了这些横档之间的距离，发现它们之间的间距为 13 到 14 纳米，这一数值与理论设计以及之前用电子显微镜测得的结果相吻合。这证实了这些纳米管不仅结构坚硬，而且组装具有完美的几何精度。

研究还观察了管子的单个片段（即横档），这些片段可以被分离出来单独成像。这些较小的部分提供了一个测试显微镜测量更短距离能力的机会。研究人员发现，在单个横档内部，荧光标记物的间距约为 7 到 8 纳米。在许多情况下，显微镜能够完美地解析这些微小的间隙，与预期设计相符。然而，他们也观察到，有时标记物看起来会发生畸变或缺失。通过仔细分析数据，他们确定这些误差并非由于 DNA 结构本身存在缺陷。相反，标记物的缺失很可能是由管子附着的表面，或者是由于显微镜的高强度光照随时间推移对对接位点造成了损伤所致。这一区分至关重要，因为它证明了 DNA 尺子本身是可靠的，任何误差都源于实验条件。

研究人员得出结论，这些线框 DNA 纳米管是一种多功能且稳健的工具，可用于校准超分辨率显微镜。它们易于构建，仅需简单的加热和冷却过程即可完成链的组装。它们兼容不同类型的荧光染料，并可以使用各种显微镜设置进行成像。最重要的是，它们提供了一个可靠且刚性的标准，可以测量两个不同尺度上的距离：管段之间的 13 到 14 纳米间距，以及单个段内部的 7 到 8 纳米间距。通过提供一个简单、可重复且高度准确的参考，这些 DNA 纳米管让科学家们能够比以往任何时候都更加信任他们的图像，确保他们在生物世界中所看到的微小细节是真实存在的。