Rigidified and modular wireframe DNA nanotubes as nanorulers to validate super resolution imaging techniques

Para ver el mundo invisible dentro de una célula viva, los científicos han desarrollado microscopios que pueden resolver detalles mucho más pequeños que la longitud de onda de la luz. Estas técnicas de superresolución funcionan encendiendo y apagando moléculas fluorescentes individuales, capturando sus posiciones una por una y luego uniendo las piezas para formar una imagen nítida. Sin embargo, para confiar en estas imágenes, los investigadores necesitan una regla estándar para comprobar si sus instrumentos están midiendo correctamente. Así como un carpintero necesita un borde recto para verificar el corte de una sierra, un científico necesita una estructura con una forma conocida y precisa para probar si su microscopio está viendo la verdad. Durante años, crear tal regla ha sido difícil porque los materiales utilizados eran demasiado flexibles, demasiado difíciles de construir o demasiado complejos de etiquetar de manera consistente.

Un equipo de investigadores de la Universidad McGill y del Laboratorio Europeo de Biología Molecular ha creado ahora un nuevo tipo de regla hecha enteramente de ADN. Diseñaron un tubo hueco y rígido construido con solo cuatro o cinco cadenas cortas de ADN. Esta estructura, que llaman nanotubo de ADN de armazón de alambre (wireframe), está diseñada para ser excepcionalmente rígida y perfectamente simétrica. Al ensamblar estos tubos y sus segmentos individuales más pequeños, el equipo produjo una herramienta que puede verificar la precisión de los sistemas de imagen más avanzados, incluyendo una tecnología de vanguardia llamada MINFLUX. Su trabajo demuestra que estos tubos de ADN no solo son fáciles de fabricar, sino que también mantienen su forma con tal precisión que pueden medir distancias de tan solo siete nanómetros, proporcionando un punto de referencia fiable para el futuro de la imagen a nanoescala.

El desafío en este campo es que muchos estándares existentes son defectuosos. Algunos están hechos de proteínas que pueden deformarse, mientras que otros se construyen utilizando métodos complejos que los hacen costosos y difíciles de reproducir. Si una regla se dobla o si las etiquetas adheridas a ella están sueltas, las mediciones tomadas por el microscopio serán erróneas. Los investigadores quisieron resolver esto creando una estructura que fuera simple de ensamblar, increíblemente rígida y fácil de etiquetar. Recurrieron a un diseño conocido como nanotubo de armazón de alambre. Imagine un andamio hecho de postes delgados; en este caso, los postes son hebras de ADN. El equipo utilizó un patrón específico donde estas hebras se cruzan entre sí para formar un tubo hueco y resistente. Construyeron versiones con secciones transversales triangulares, cuadradas y pentagonales, todas hechas a partir del mismo conjunto pequeño de piezas de ADN.

Para que estos tubos sean útiles para la imagen, los investigadores adjuntaron diminutos sitios de acoplamiento a lo largo de los lados del tubo. Estos sitios actúan como plataformas de aterrizaje para cortas hebras de ADN fluorescentes que flotan en el líquido que rodea la muestra. Cuando una hebra fluorescente aterriza en un sitio de acoplamiento, brilla brevemente antes de flotar lejos, permitiendo que el microscopio registre su posición exacta. Debido a que los sitios de acoplamiento están construidos directamente en las hebras de ADN que forman el tubo, los marcadores fluorescentes se sitúan exactamente donde deben estar, sin ningún conector suelto que pudiera alterar la medición. El equipo también añadió una etiqueta pegajosa en un extremo del tubo para que se uniera firmemente a una placa de vidrio, asegurando que la estructura permaneciera inmóvil durante el proceso de imagen.

La primera prueba consistió en ver si los tubos eran lo suficientemente rígidos como para servir de regla. Los investigadores utilizaron una técnica de superresolución estándar para mapear las posiciones de los marcadores fluorescentes a lo largo de la longitud de los tubos. Encontraron que los tubos eran notablemente rectos, resistiendo la tendencia natural del ADN a doblarse y retorcerse. Al analizar la forma de cientos de estos tubos, calcularon una medida de rigidez conocida como longitud de persistencia, que resultó ser de aproximadamente 1,6 micrómetros. Esto significa que los tubos son unas treinta o cuarenta veces más rígidos que una hélice de ADN de doble cadena estándar, lo que los convierte en una de las estructuras de ADN más rígidas jamás reportadas. Esta rigidez confirmó que los tubos no se distorsionarían bajo la presión del microscopio, proporcionando una referencia estable para las mediciones.

A continuación, el equipo llevó la tecnología más allá utilizando un método de imagen más potente llamado DNA-PAINT MINFLUX. Esta técnica utiliza un haz de láser con forma de dona para localizar la ubicación de una sola molécula con extrema precisión, utilizando muchas menos partículas de luz que los métodos tradicionales. Cuando imaginaron los tubos de ADN con este sistema, los resultados fueron sorprendentes. El microscopio podía distinguir claramente los segmentos individuales, o "peldaños", que componían el tubo. Los investigadores midieron la distancia entre estos peldaños y encontraron que estaban espaciados entre 13 y 14 nanómetros, un valor que coincidía con el diseño teórico y con las mediciones previas realizadas con microscopios electrónicos. Esto confirmó que los tubos no solo eran rígidos, sino que también estaban ensamblados con una precisión geométrica perfecta.

El estudio también analizó los segmentos individuales del tubo, conocidos como peldaños, que podían aislarse e imaginarse por separado. Estas piezas más pequeñas ofrecieron la oportunidad de probar la capacidad del microscopio para medir distancias aún más cortas. Los investigadores descubrieron que, dentro de un solo peldaño, los marcadores fluorescentes estaban espaciados entre 7 y 8 nanómetros. En muchos casos, el microscopio podía resolver estos diminutos huecos perfectamente, coincidiendo con el diseño previsto. Sin embargo, también observaron que, a veces, los marcadores aparecían distorsionados o ausentes. Al analizar los datos cuidadosamente, determinaron que estos errores no se debían a que la estructura de ADN fuera defectuosa. En cambio, los marcadores ausentes probablemente fueron causados por la superficie a la que estaba unido el tubo, o por la intensa luz del microscopio que dañaba los sitios de acoplamiento con el tiempo. Esta distinción fue crucial, ya que demostró que la regla de ADN era sólida y que cualquier error provenía de las condiciones experimentales.

Los investigadores concluyeron que estos nanotubos de ADN de armazón de alambre son una herramienta versátil y robusta para calibrar microscopios de superresolución. Son fáciles de construir, requiriendo solo un proceso simple de calentamiento y enfriamiento para ensamblar las hebras. Son compatibles con diferentes tipos de tintes fluorescentes y pueden ser imaginados utilizando diversos montajes de microscopios. Lo más importante es que proporcionan un estándar rígido y fiable que puede medir distancias en dos escalas diferentes: el espaciado de 13 a 14 nanómetros entre los segmentos del tubo y el espaciado de 7 a 8 nanómetros dentro de un solo segmento. Al ofrecer una referencia simple, reproducible y altamente precisa, estos nanotubos de ADN permiten que los científicos confíen en sus imágenes más que nunca, asegurando que los diminutos detalles que ven en el mundo biológico sean reales.