Rigidified and modular wireframe DNA nanotubes as nanorulers to validate super resolution imaging techniques
यह अध्ययन एक कठोर, मॉड्यूलर और आसानी से निर्मित होने वाले वायरफ्रेम डीएनए नैनोट्यूब (DxNT) को प्रस्तुत करता है जो एक बहुमुखी और सुदृढ़ नैनोरूलर के रूप में कार्य करता है जिसमें अंतर्निहित उच्च लेबलिंग दक्षता है, जो प्रभावी रूप से विविध सुपर-रेज़ोल्यूशन माइक्रोस्कोपी तकनीकों के प्रदर्शन को प्रमाणित करता है।
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जीवित कोशिका के भीतर अदृंत दुनिया को देखने के लिए, वैज्ञानिकों ने ऐसे सूक्ष्मदर्शी (microscopes) विकसित किए हैं जो प्रकाश की तरंग दैर्ध्य (wavelength) से कहीं अधिक सूक्ष्म विवरणों को स्पष्ट कर सकते हैं। ये सुपर-रेज़ोल्यूशन तकनीकें व्यक्तिगत फ्लोरोसेंट अणुओं को चालू और बंद करके काम करती हैं, उनके स्थानों को एक-एक करके कैप्चर करती हैं, और फिर उन्हें एक स्पष्ट छवि में जोड़ने का काम करती हैं। हालाँकि, इन छवियों पर भरोसा करने के लिए, शोधकर्ताओं को एक मानक पैमाने (standard ruler) की आवश्यकता होती है ताकि वे यह जाँच सकें कि उनके उपकरण सही ढंग से माप रहे हैं या नहीं। जिस तरह एक बढ़ई को अपनी आरी के कट की सत्यता जाँचने के लिए एक सीधी धार वाली वस्तु की आवश्यकता होती है, उसी तरह एक वैज्ञानिक को एक ऐसी संरचना की आवश्यकता होती है जिसका आकार ज्ञात और सटीक हो, ताकि वह परीक्षण कर सके कि सूक्ष्मदर्शी क्या सच देख रहा है। वर्षों तक, ऐसा पैमाना बनाना कठिन रहा क्योंकि उपयोग की जाने वाली सामग्रियाँ या तो बहुत लचीली थीं, या उन्हें बनाना बहुत कठिन था, या उन्हें लगातार लेबल करना बहुत जटिल था।
मैकिल विश्वविद्यालय (McGill University) और यूरोपीय आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशाला (European Molecular Biology Laboratory) के शोधकर्ताओं की एक टीम ने अब पूरी तरह से डीएनए (DNA) से बना एक नया प्रकार का पैमाना तैयार किया है। उन्होंने केवल चार या पांच छोटी डीएनए स्ट्रैंड्स से बनी एक कठोर, खोखली नली को डिजाइन किया। इस संरचना को, जिसे वे 'वायरफ्रेम डीएनए नैनोट्यूब' कहते हैं, असाधारण रूप से सख्त और पूर्णतः सममित (symmetrical) बनाया गया है। इन ट्यूबों और उनके छोटे, व्यक्तिगत खंडों को जोड़ने के बाद, टीम ने एक ऐसा उपकरण तैयार किया जो MINFLUX नामक एक अत्याधुनिक तकनीक सहित सबसे उन्नत इमेजिंग सिस्टम की सटीकता को सत्यापित कर सकता है। उनका कार्य यह प्रदर्शित करता है कि ये डीएनए ट्यूब न केवल बनाने में आसान हैं, बल्कि वे इतनी सटीकता के साथ अपना आकार बनाए रखते हैं कि वे सात नैनोमीटर जितनी छोटी दूरियों को भी माप सकते हैं, जिससे भविष्य की नैनोस्केल इमेजिंग के लिए एक विश्वसनीय बेंचमार्क प्राप्त होता है।
इस क्षेत्र की चुनौती यह है कि कई मौजूदा मानक त्रुटिपूर्ण हैं। कुछ प्रोटीन से बने होते हैं जो मुड़ सकते हैं, जबकि अन्य जटिल विधियों का उपयोग करके बनाए जाते हैं जो उन्हें महंगा और पुनरुत्पादित (reproduce) करना कठिन बनाते हैं। यदि पैमाना मुड़ जाता है या यदि उससे जुड़े लेबल ढीले हैं, तो सूक्ष्मदर्शी द्वारा लिए गए माप गलत होंगे। शोधकर्ता इसे हल करने के लिए एक ऐसी संरचना बनाना चाहते थे जो असेंबल करने में सरल, अविश्वसनीय रूप से कठोर और लेबल करने में आसान हो। उन्होंने 'वायरफ्रेम नैनोट्यूब' के रूप में जानी जाने वाली डिज़ाइन की ओर रुख किया। एक मचान (scaffold) की कल्पना करें जो पतले खंभों से बना हो; इस मामले में, वे खंभे डीएनए की स्ट्रैंड्स हैं। टीम ने एक विशिष्ट पैटर्न का उपयोग किया जहाँ ये स्ट्रैंड एक मजबूत, खोखली नली बनाने के लिए एक-दूसरे के ऊपर क्रॉस होते हैं। उन्होंने त्रिकोणीय, वर्गाकार और पंचकोणीय क्रॉस-सेक्शन वाले संस्करण बनाए, जो सभी डीएनए के एक ही छोटे सेट से निर्मित थे।
इन ट्यूबों को इमेजिंग के लिए उपयोगी बनाने के लिए, शोधकर्ताओं ने ट्यूब के किनारों पर छोटे 'डॉकिंग साइट्स' (docking sites) लगाए। ये साइट्स नमूने के आसपास के तरल में तैरने वाले छोटे, फ्लोरोसेंट डीएनए स्ट्रैंड्स के लिए लैंडिंग पैड के रूप में कार्य करते हैं। जब एक फ्लोरोसेंट स्ट्रैंड डॉकिंग साइट पर उतरता है, तो वह बह जाने से पहले थोड़े समय के लिए चमकता है, जिससे सूक्ष्मदर्शी उसकी सटीक स्थिति रिकॉर्ड कर पाता है। क्योंकि डॉकिंग साइट्स को सीधे उन डीएनए स्ट्रैंड्स में बनाया गया है जो ट्यूब बनाते हैं, इसलिए फ्लोरोसेंट मार्कर ठीक वहीं बैठते हैं जहाँ उन्हें होना चाहिए, बिना किसी ढीले कनेक्टर के जो माप को बिगाड़ सके। टीम ने ट्यूब के एक छोर पर एक चिपचिपा टैग (sticky tag) भी जोड़ा ताकि यह ग्लास स्लाइड से मजबूती से जुड़ सके, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान संरचना स्थिर रहे।
पहला परीक्षण यह देखने के लिए था कि क्या ट्यूब इतने कठोर थे कि वे एक पैमाने के रूप में काम कर सकें। शोधकर्ताओं ने ट्यूबों की लंबाई के साथ फ्लोरोसेंट मार्करों की स्थिति को मैप करने के लिए एक मानक सुपर-रेज़ॉल्यूशन तकनीक का उपयोग किया। उन्होंने पाया कि ट्यूब उल्लेखनीय रूप से सीधे थे, जो डीएनए के मुड़ने और मुड़ने की प्राकृतिक प्रवृत्ति का विरोध करते हैं। सैकड़ों ट्यूबों के आकार का विश्लेषण करके, उन्होंने 'परसिस्टेंस लेंथ' (persistence length) नामक कठोरता के माप की गणना की, जो लगभग 1.6 माइक्रोमीटर निकली। इसका अर्थ है कि ये ट्यूब एक मानक डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए हेलिक्स की तुलना में तीस से चालीस गुना अधिक कठोर हैं, जो उन्हें अब तक की सबसे कठोर डीएनए संरचनाओं में से एक बनाता है। इस कठोरता ने पुष्टि की कि ट्यूब सूक्ष्मदर्शी के दबाव में विकृत नहीं होंगे, जिससे मापों के लिए एक स्थिर संदर्भ प्राप्त होगा।
इसके बाद, टीम ने 'डीएनए-पेंट MINFLUX' (DNA-PAINT MINFLUX) नामक अधिक शक्तिशाली इमेजिंग पद्धति का उपयोग करके तकनीक को आगे बढ़ाया। यह तकनीक एक डोनट के आकार की लेजर बीम का उपयोग करती है ताकि अत्यधिक सटीकता के साथ एकल अणु के स्थान को पहचाना जा सके, जिसमें पारंपरिक तरीकों की तुलना में बहुत कम प्रकाश कणों का उपयोग होता है। जब उन्होंने इस प्रणाली के साथ डीएनए ट्यूबों की इमेजिंग की, तो परिणाम चौंकाने वाले थे। सूक्ष्मदर्शी ट्यूब को बनाने वाले व्यक्तिगत खंडों, या "रंग्स" (rungs), को स्पष्ट रूप से पहचान सका। शोधकर्ताओं ने इन रंग्स के बीच की दूरी को मापा और पाया कि वे 13 से 14 नैनोमीटर की दूरी पर स्थित थे, जो कि सैद्धांतिक डिजाइन और इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी द्वारा किए गए पिछले मापों से मेल खाता है। इसने पुष्टि की कि ट्यूब न केवल कठोर थे, बल्कि उन्हें पूर्ण ज्यामितीय सटीकता के साथ असेंबल भी किया गया था।
अध्ययन में ट्यूब के व्यक्तिगत खंडों, जिन्हें 'रंग्स' कहा जाता है, का भी अध्ययन किया गया, जिन्हें अलग करके और स्वतंत्र रूप से इमेज किया जा सकता था। इन छोटे टुकड़ों ने सूक्ष्मदर्शी की और भी छोटी दूरियों को मापने की क्षमता का परीक्षण करने का अवसर दिया। शोधकर्ताओं ने पाया कि एक एकल रंंग के भीतर, फ्लोरोसेंट मार्कर 7 से 8 नैनोमीटर की दूरी पर स्थित थे। कई मामलों में, सूक्ष्मदर्शी इन सूक्ष्म अंतरालों को पूरी तरह से स्पष्ट कर सका, जो इच्छित डिजाइन के अनुरूप था। हालाँकि, उन्होंने यह भी देखा कि कभी-कभी मार्कर विकृत या गायब दिखाई देते थे। डेटा का सावधानीपूर्वक विश्लेषण करके, उन्होंने निर्धारित किया कि ये त्रुटियां डीएनए संरचना की खामी के कारण नहीं थीं। इसके बजाय, गायब मार्कर संभवतः उस सतह के कारण थे जिससे ट्यूब जुड़ा हुआ था, या सूक्ष्मदर्शी की तीव्र रोशनी के कारण समय के साथ डॉकिंग साइट्स को नुकसान पहुँच रहा था। यह अंतर महत्वपूर्ण था, क्योंकि इसने सिद्ध किया कि डीएनए का पैमाना स्वयं सुदृढ़ था, और कोई भी त्रुटि प्रयोगात्मक स्थितियों के कारण थी।
शोधकर्ताओं ने निष्कर्ष निकाला कि ये वायरफ्रेम डीएनए नैनोट्यूब सुपर-रेज़ोल्यूशन सूक्ष्मदर्शी को कैलिब्रेट करने के लिए एक बहुमुखी और मजबूत उपकरण हैं। इन्हें बनाना आसान है, जिसके लिए स्ट्रैंड्स को जोड़ने के लिए केवल एक सरल हीटिंग और कूलिंग प्रक्रिया की आवश्यकता होती है। ये विभिन्न प्रकार के फ्लोरोसेंट रंगों के साथ संगत हैं और इन्हें विभिन्न सूक्ष्मदर्शी सेटअप का उपयोग करके इमेज किया जा सकता है। सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि वे दो अलग-अलग पैमानों पर दूरियों को मापने के लिए एक विश्वसनीय, कठोर मानक प्रदान करते हैं: ट्यूब सेगमेंट के बीच 13 से 14 नैनोमीटर की दूरी और एक एकल सेगमेंट के भीतर 7 से 8 नैनोमीटर की दूरी। एक सरल, पुनरुत्पादित और अत्यधिक सटीक संदर्भ प्रदान करके, ये डीएनए नैनोट्यूब वैज्ञानिकों को उनकी छवियों पर पहले से कहीं अधिक विश्वास करने की अनुमति देते हैं, जिससे यह सुनिश्चित होता है कि जैविक दुनिया में वे जो सूक्ष्म विवरण देखते हैं, वे वास्तविक हैं।
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