Rigidified and modular wireframe DNA nanotubes as nanorulers to validate super resolution imaging techniques

Om de onzichtbare wereld binnen een levende cel te kunnen zien, hebben wetenschappers microscopen ontwikkeld die details kunnen waarnemen die veel kleiner zijn dan de golflengte van het licht. Deze superresolutie-technieken werken door individuele fluorescente moleculen aan en uit te zetten, hun posities één voor één vast te leggen, en deze vervolgens aan elkaar te naaien tot een scherp beeld. Om deze beelden echter te kunnen vertrouwen, hebben onderzoekers een standaard liniaal nodig om te controleren of hun instrumenten correct meten. Net zoals een timmerman een rechte rand nodig heeft om de snede van een zaag te verifiëren, heeft een wetenschapper een structuur met een bekende, precieze vorm nodig om te testen of een microscoop de waarheid ziet. Jarenlang was het creëren van een dergelijke liniaal moeilijk omdat de gebruikte materialen ofwel te slap waren, ofwel te moeilijk om te bouwen, of te complex om consistent te labelen.

Een team van onderzoekers aan de McGill University en het European Molecular Biology Laboratory heeft nu een nieuw soort liniaal gemaakt die volledig uit DNA bestaat. Ze ontwierpen een stijve, holle buis die is opgebouwd uit slechts vier of vijf korte strengen DNA. Deze structuur, die ze een wireframe DNA-nanobuis noemen, is ontworpen om uitzonderlijk stijf en perfect symmetrisch te zijn. Door deze buizen en hun kleinere, individuele segmenten te assembleren, produceerde het team een hulpmiddel dat de nauwkeurigheid van de meest geavanceerde beeldvormingssystemen, inclusief een baanbrekende technologie genaamd MINFLUX, kan verifiëren. Hun werk toont aan dat deze DNA-buizen niet alleen gemakkelijk te maken zijn, maar ook hun vorm behouden met een dergelijke precisie dat ze afstanden zo klein als zeven nanometer kunnen meten, wat een betrouwbare benchmark biedt voor de toekomst van de nanoschaal-beeldvorming.

De uitdaging in dit veld is dat veel bestaande standaarden gebrekkig zijn. Sommige zijn gemaakt van eiwitten die kunnen vervormen, terwijl andere zijn gebouwd met complexe methoden die ze duur en moeilijk reproduceerbaar maken. Als een liniaal buigt of als de labels die eraan bevestigd zijn loszitten, zullen de metingen die de microscoop maakt onjuist zijn. De onderzoekers wilden dit oplossen door een structuur te creëren die eenvoudig te assembleren, ongelooflijk stijf en gemakkelijk te labelen was. Ze wenden zich tot een ontwerp dat bekend staat als een wireframe nanotube. Stel je een steiger voor gemaakt van dunne palen; in dit geval zijn de palen strengen DNA. Het team gebruikte een specifiek patroon waarbij deze strengen over elkaar heen kruisen om een sterke, holle buis te vormen. Ze bouwden versies met driehoekige, vierkante en vijfhoekige dwarsdoorsneden, allemaal gemaakt van dezelfde kleine set DNA-stukjes.

Om deze buizen bruikbaar te maken voor beeldvorming, bevestigden de onderzoekers kleine dockingplaatsen langs de zijkanten van de buis. Deze plaatsen fungeren als landingsplaatsen voor korte, fluorescente DNA-strengjes die in de vloeistof rond het monster zweven. Wanneer een fluorescente streng op een dockingplaats landt, geeft deze kortstondig licht voordat hij weer weg zweeft, waardoor de microscoop zijn exacte positie kan registragen. Omdat de dockingplaatsen direct in de DNA-strengen zijn gebouwd die de buis vormen, zitten de fluorescente markeringen precies waar ze horen te zitten, zonder enige losse verbindingen die de meting zouden kunnen verstoren. Het team voegde ook een plaktag toe aan één uiteinde van de buis, zodat deze stevig aan een glazen plaat zou hechten, wat ervoor zorgt dat de structuur stil blijft liggen tijdens het beeldvormingsproces.

De eerste test was om te zien of de buizen stijf genoeg waren om als liniaal te dienen. De onderzoekers gebruikten een standaard superresolutie-techniek om de posities van de fluorescente markeringen langs de lengte van de buizen in kaart te brengen. Ze ontdekten dat de buizen opmerkelijk recht waren en de natuurlijke neiging van DNA om te buigen en te draaien weerstonden. Door de vorm van honderden van deze buizen te analyseren, berekenden ze een maat voor stijfheid die de persistentielengte wordt genoemd, welke uitkwam op ongeveer 1,6 micrometer. Dit betekent dat de buizen dertig tot veertig keer stijver zijn dan een standaard dubbelstrengs DNA-helix, waardoor ze behoren tot de meest rigide DNA-structuren die ooit zijn gerapporteerd. Deze stijfheid bevestigde dat de buizen niet zouden vervormen onder de druk van de microscoop, wat een stabiele referentie biedt voor metingen.

Vervolgens tilde het team de technologie naar een hoger niveau door een krachtiger beeldvormingsmethode te gebruiken die DNA-PAINT MINFLUX wordt genoemd. Deze techniek gebruikt een laserstraal in de vorm van een donut om de locatie van een enkel molecuul met extreme precisie te pinpointen, waarbij veel minder lichtdeeltjes worden gebruikt dan bij traditionele methoden. Wanneer ze de DNA-buizen met dit systeem beeldden, waren de resultaten opvallend. De microscoop kon de individuele segmenten, of "sporten", die de buis vormden, duidelijk onderscheiden. De onderzoekers maten de afstand tussen deze sporten en vonden dat deze op 13 tot 14 nanometer gespatieerd waren, een waarde die overeenkwam met het theoretische ontwerp en eerdere metingen met elektronenmicroscopen. Dit bevestigde dat de buizen niet alleen stijf waren, maar ook met perfecte geometrische precisie waren geassembleerd.

De studie bestudeerde ook de individuele segmenten van de buis, de zogenaamde sporten, die geïsoleerd en afzonderlijk konden worden afgebeeld. Deze kleinere stukken boden een kans om het vermogen van de microscoop om zelfs kortere afstanden te meten te testen. De onderzoekers ontdekten dat binnen een enkele sport de fluorescente markeringen ongeveer 7 tot 8 nanometer uit elkaar lagen. In veel gevallen kon de microscoop deze minuscule gaten perfect resolveren, wat overeenkwam met het beoogde ontwerp. Ze observeerden echter ook dat de markeringen soms vervormd of ontbrekend leken. Door de gegevens zorgvuldig te analyseren, stelden ze vast dat deze fouten niet te wijten waren aan een gebrek in de DNA-structuur zelf. In plaats daarvan waren de ontbrekende markeringen waarschijnlijk veroorzaakt door het oppervlak waaraan de buis was bevestigd, of door het intense licht van de microscoop dat de dockingplaatsen in de loop van de tijd beschadigde. Dit onderscheid was cruciaal, omdat het bewees dat de DNA-liniaal zelf deugde en dat eventuele fouten voortkwamen uit de experimentele omstandigheden.

De onderzoekers concludeerden dat deze wireframe DNA-nanobuizen een veelzijdige en robuuste tool zijn voor het kalibreren van superresolutie-microscopen. Ze zijn gemakkelijk te bouwen, waarbij enkel een eenvoudig proces van verhitting en afkoeling nodig is om de strengen te assembleren. Ze zijn compatibel met verschillende soorten fluorescente kleurstoffen en kunnen met diverse microscoopopstellingen worden afgebeeld. Het belangrijkste is dat ze een betrouwbare, stijve standaard bieden die afstanden over twee verschillende schalen kan meten: de 13 tot 14 nanometer tussen de buissegmenten en de 7 tot 8 nanometer binnen een enkel segment. Door een eenvoudige, reproduceerbare en zeer nauwkeurige referentie te bieden, zorgen deze DNA-nanobuizen ervoor dat wetenschappers hun beelden meer dan ooit kunnen vertrouwen, zodat zij er zeker van zijn dat de minuscule details die zij zien in de biologische wereld echt zijn.