Rigidified and modular wireframe DNA nanotubes as nanorulers to validate super resolution imaging techniques

Um die unsichtbare Welt im Inneren einer lebenden Zelle zu sehen, haben Wissenschaftler Mikroskope entwickelt, die Details auflösen können, die weit kleiner sind als die Wellenlänge des Lichts. Diese Super-Resolution-Techniken funktionieren, indem sie einzelne fluoreszierende Moleküle ein- und ausschalten, deren Positionen nacheinander erfassen und diese dann zu einem scharfen Bild zusammensetzen. Um diesen Bildern jedoch zu vertrauen, benötigen Forscher ein Standardmaßstab, um zu überprüfen, ob ihre Instrumente korrekt messen. Genau wie ein Zimmermann eine gerade Kante benötigt, um den Schnitt einer Säge zu verifizieren, braucht ein Wissenschaftler eine Struktur mit einer bekannten, präzisen Form, um zu testen, ob ein Mikroskop die Wahrheit sieht. Jahrelang war die Erstellung eines solchen Lineals schwierig, da die verwendeten Materialien entweder zu biegsam, zu schwer herzustellen oder zu komplex zu markieren waren.

Ein Team von Forschern der McGill University und der Europäischen Molekularbiologischen Laboratoriums hat nun eine neue Art von Lineal entwickelt, das vollständig aus DNA besteht. Sie entwarfen ein starres, hohles Rohr, das aus nur vier oder fünf kurzen DNA-Strängen konstruiert ist. Diese Struktur, die sie einen Drahtgitter-DNA-Nanoröhrchen nennen, ist so gebaut, dass sie außergewöhnlich steif und perfekt symmetrisch ist. Durch die Assemblierung dieser Röhren und ihrer kleineren, einzelnen Segmente produzierte das Team ein Werkzeug, das die Genauigkeit der fortschrittlichsten Bildgebungssysteme, einschließlich einer bahnbrechenden Technologie namens MINFLUX, verifizieren kann. Ihre Arbeit zeigt, dass diese DNA-Röhren nicht nur einfach herzustellen sind, sondern auch ihre Form mit einer solchen Präzision halten, dass sie Abstände von nur sieben Nanometern messen können, was einen zuverlässigen Maßstab für die Zukunft der nanoskaligen Bildgebung bietet.

Die Herausforderung in diesem Bereich besteht darin, dass viele bestehende Standards fehlerhaft sind. Einige bestehen aus Proteinen, die sich verformen können, während andere mit komplexen Methoden gebaut werden, die sie teuer und schwierig reproduzierbar machen. Wenn ein Lineal verbogen ist oder wenn die daran angehefteten Markierungen locker sitzen, werden die vom Mikroskop gemessenen Werte falsch sein. Die Forscher wollten dies lösen, indem sie eine Struktur schufen, die einfach zu montieren, unglaublich starr und leicht zu markieren war. Sie wandten sich einem Design zu, das als Drahtgitter-Nanoröhrchen bekannt ist. Stellen Sie sich ein Gerüst aus dünnen Stangen vor; in diesem Fall sind die Stangen DNA-Stränge. Das Team nutzte ein spezifisches Muster, bei dem sich diese Stränge überkreuzen, um ein starkes, hohles Rohr zu bilden. Sie bauten Versionen mit dreieckigen, quadratischen und pentagonalen Querschnitten, die alle aus demselben kleinen Satz von DNA-Stücken bestehen.

Um diese Röhren für die Bildgebung nützlich zu machen, fügten die Forscher entlang der Seiten des Rohrs winzige Andockstellen an. Diese Stellen fungieren als Landeplätze für kurze, fluoreszierende DNA-Stränge, die in der Flüssigkeit um die Probe herum schwimmen. Wenn ein fluoreszierender Strang auf einer Andockstelle landet, leuchtet er kurz auf, bevor er wieder wegtreibt, wodurch das Mikroskop seine exakte Position aufzeichnen kann. Da die Andockstellen direkt in die DNA-Stränge eingebaut sind, die das Rohr bilden, sitzen die fluoreszierenden Marker genau dort, wo sie sein sollen, ohne dass es lose Verbindungen gibt, die die Messung verfälschen könnten. Das Team fügte auch ein klebriges Etikett an einem Ende des Rohrs hinzu, damit es fest an einem Objektträger befestigt bleibt und sicherstellt, dass die Struktur während des Bildgebungsprozesses ruhig bleibt.

Der erste Test bestand darin, zu sehen, ob die Röhren steif genug sind, um als Lineal zu dienen. Die Forscher verwendeten eine Standard-Super-Resolution-Technik, um die Positionen der fluoreszierenden Marker entlang der Länge der Röhren abzubilden. Sie fanden heraus, dass die Röhren bemerkenswert gerade waren und der natürlichen Tendenz von DNA, sich zu biegen und zu verdrehen, widerstanden. Durch die Analyse der Form von Hunderten dieser Röhren berechneten sie ein Maß für die Steifigkeit, die sogenannte Persistenzlänge, die etwa 1,6 Mikrometer betrug. Dies bedeutet, dass die Röhren etwa dreißig bis vierzig Mal steifer sind als eine standardmäßige doppelsträngige DNA-Helix, was sie zu den steifsten DNA-Strukturen macht, die jemals berichtet wurden. Diese Rigidität bestätigte, dass die Röhren unter dem Druck des Mikroskops nicht deformiert würden, was einen stabilen Referenzpunkt für Messungen lieferte.

Als Nächstes trieb das Team die Technologie mit einer leistungsfähigeren Bildgebungsmethode namens DNA-PAINT MINFLUX voran. Diese Technik verwendet einen Laserstrahl, der wie ein Donut geformt ist, um den Ort eines einzelnen Moleküls mit extremer Präzision zu bestimmen, wobei viel weniger Lichtteilchen als bei herkömmlichen Methoden verwendet werden. Als sie die DNA-Röhren mit diesem System untersuchten, waren die Ergebnisse beeindruckend. Das Mikroskop konnte die einzelnen Segmente oder „Sprossen“, aus denen das Rohr besteht, deutlich unterscheiden. Die Forscher maßen den Abstand zwischen diesen Sprossen und fanden heraus, dass sie in einem Abstand von 13 bis 14 Nanometern liegen, ein Wert, der dem theoretischen Design und früheren Messungen mit Elektronenmikroskopen entsprach. Dies bestätigte, dass die Röhren nicht nur starr, sondern auch mit perfekter geometrischer Präzision montiert waren.

Die Studie untersuchte auch die einzelnen Segmente des Rohrs, die sogenannten Sprossen, welche isoliert und separat abgebildet werden konnten. Diese kleineren Teile boten die Möglichkeit, die Fähigkeit des Mikroskops zu testen, noch kürzere Abstände zu messen. Die Forscher fanden heraus, dass innerhalb einer einzigen Sprosse die fluoreszierenden Marker etwa 7 bis 8 Nanometer voneinander entfernt sind. In vielen Fällen konnte das Mikroskop diese winzigen Lücken perfekt auflösen, was dem beabsichtigten Design entsprach. Sie beobachteten jedoch auch, dass die Marker manchmal verzerrt oder fehlend erschienen. Durch eine sorgfältige Analyse der Daten stellten sie fest, dass diese Fehler nicht darauf zurückzuführen waren, dass die DNA-Struktur selbst fehlerhaft war. Stattdessen war es wahrscheinlich, dass die fehlenden Marker durch die Oberfläche, an der das Rohr befestigt war, oder durch das intensive Licht des Mikroskops verursacht wurden, welches die Andockstellen im Laufe der Zeit beschädigte. Diese Unterscheidung war entscheidend, da sie bewies, dass das DNA-Lineal selbst intakt war und etwaige Fehler aus den Versuchsbedingungen resultierten.

Die Forscher kamen zu dem Schluss, dass diese Drahtgitter-DNA-Nanoröhrchen ein vielseitiges und robustes Werkzeug zur Kalibrierung von Super-Resolution-Mikroskopen sind. Sie sind einfach herzustellen, da sie lediglich einen einfachen Heiz- und Kühlprozess zum Zusammenfügen der Stränge erfordern. Sie sind mit verschiedenen Arten von fluoreszierenden Farbstoffen kompatibel und können mit verschiedenen Mikroskop-Aufbauten untersucht werden. Vor allem bieten sie einen zuverlässigen, starren Standard, der Abstände auf zwei verschiedenen Skalen messen kann: den 13- bis 14-Nanometer-Abstand zwischen den Tubensegmenten und den 7- bis 8-Nanometer-Abstand innerhalb eines einzelnen Segments. Indem sie einen einfachen, reproduzierbaren und hochpräzisen Referenzwert bieten, ermöglichen diese DNA-Nanoröhrchen den Wissenschaftlern, ihren Bildern mehr denn je zu vertrauen und sicherzustellen, dass die winzigen Details, die sie in der biologischen Welt sehen, real sind.