Rigidified and modular wireframe DNA nanotubes as nanorulers to validate super resolution imaging techniques

Per vedere il mondo invisibile all'interno di una cella vivente, gli scienziati hanno sviluppato microscopi in grado di risolvere dettagli molto più piccoli della lunghezza d'onda della luce. Queste tecniche di super-risoluzione funzionano accendendo e spegnendo singole molecole fluorescenti, catturando le loro posizioni una alla volta e poi assemblandole in un'immagine nitida. Tuttavia, per fidarsi di queste immagini, i ricercatori hanno bisogno di un righello standard per verificare se i loro strumenti misurano correttamente. Proprio come un carpentiere ha bisogno di una squadra per verificare il taglio di una sega, uno scienziato ha bisogno di una struttura con una forma nota e precisa per testare se il microscopio sta vedendo la verità. Per anni, creare un tale righello è stato difficile perché i materiali utilizzati erano o troppo flessibili, o troppo difficili da costruire, o troppo complessi da marcare in modo coerente.

Un team di ricercatori dell'Università McGill e del Laboratorio Europeo di Biologia Molecolare ha creato ora un nuovo tipo di righello fatto interamente di DNA. Hanno progettato un tubo cavo e rigido costruito con soli quattro o cinque brevi filamenti di DNA. Questa struttura, che chiamano nanotubo di DNA a intelaiatura (wireframe), è progettata per essere eccezionalmente rigida e perfettamente simmetrica. Assemblando questi tubi e i loro segmenti più piccoli, il team ha prodotto uno strumento in grado di verificare l'accuratezza dei sistemi di imaging più avanzati, inclusa una tecnologia all'avanguardia chiamata MINFLUX. Il loro lavoro dimostra che questi tubi di DNA non sono solo facili da realizzare, ma mantengono la loro forma con tale precisione da poter misurare distanze anche di soli sette nanometri, fornendo un riferimento affidabile per il futuro dell'imaging a scala nanometrica.

La sfida in questo campo è che molti standard esistenti sono difettosi. Alcuni sono fatti di proteine che possono deformarsi, mentre altri sono costruiti utilizzando metodi complessi che li rendono costosi e difficili da riprodurre. Se un righello si piega o se le etichette attaccate ad esso sono allentate, le misurazioni effettuate dal microscopio saranno errate. I ricercatori volevano risolvere questo problema creando una struttura che fosse semplice da assemblare, incredibilmente rigida e facile da marcare. Si sono rivolti a un design noto come nanotubo a intelaiatura. Immaginate un'impalcatura fatta di sottili pali; in questo caso, i pali sono filamenti di DNA. Il team ha utilizzato un modello specifico in cui questi filamenti si incrociano tra loro per formare un tubo cavo e resistente. Hanno costruito versioni con sezioni trasversali triangolari, quadrate e pentagonali, tutte realizzate con lo stesso piccolo set di pezzi di DNA.

Per rendere questi tubi utili per l'imaging, i ricercatori hanno attaccato dei minuscoli siti di attracco lungo i lati del tubo. Questi siti agiscono come piattaforme di atterraggio per brevi filamenti di DNA fluorescenti che galleggiano nel liquido circostante il campione. Quando un filamento fluorescente atterra su un sito di attracco, brilla brevemente prima di allontanarsi, permettendo al microscopio di registrare la sua posizione esatta. Poiché i siti di attracco sono costruiti direttamente nei filamenti di DNA che formano il tubo, i marcatori fluorescenti si trovano esattamente dove dovrebbero stare, senza alcun connettore allentato che potrebbe falsare la misurazione. Il team ha anche aggiunto un tag appiccicoso a un'estremità del tubo in modo che si attacchi saldamente a un vetrino da microscopio, garantendo che la struttura rimanesse ferma durante il processo di imaging.

Il primo test consisteva nel vedere se i tubi fossero abbastanza rigidi da servire come righello. I ricercatori hanno utilizzato una tecnica standard di super-risoluzione per mappare le posizioni dei marcatori fluorescenti lungo la lunghezza dei tubi. Hanno scoperto che i tubi erano straordinariamente dritti, resistendo alla naturale tendenza del DNA a piegarsi e torcersi. Analizzando la forma di centinaia di questi tubi, hanno calcolato una misura di rigidità nota come lunghezza di persistenza, che è risultata essere di circa 1,6 micrometri. Ciò significa che i tubi sono circa trenta o quaranta volte più rigidi di una normale elica di DNA a doppio filamento, rendendoli tra le strutture di DNA più rigide mai riportate. Questa rigidità ha confermato che i tubi non si sarebbero deformati sotto la pressione del microscopio, fornendo un riferimento stabile per le misurazioni.

Successivamente, il team ha spinto la tecnologia oltre utilizzando un metodo di imaging più potente chiamato DNA-PAINT MINFLUX. Questa tecnica utilizza un fascio laser a forma di ciambella (donut) per individuare la posizione di una singola molecola con estrema precisione, utilizzando molti meno fotoni rispetto ai metodi tradizionali. Quando hanno esaminato i tubi di DNA con questo sistema, i risultati sono stati sorprendenti. Il microscopio riusciva a distinguere chiaramente i singoli segmenti, o "pioli", che componevano il tubo. I ricercatori hanno misurato la distanza tra questi pioli e hanno scoperto che erano spaziati di 13-14 nanometri, un valore che corrispondeva al design teorico e alle precedenti misurazioni effettuate con i microscopi elettronici. Ciò ha confermato che i tubi non erano solo rigidi, ma erano anche assemblati con una precisione geometrica perfetta.

Lo studio ha anche esaminato i singoli segmenti del tubo, i cosiddetti pioli, che potevano essere isolati e immagini separatamente. Questi pezzi più piccoli offrivano l'opportunità di testare la capacità del microscopio di misurare distanze ancora più brevi. I ricercatori hanno scoperto che, all'interno di un singolo piolo, i marcatori fluorescenti erano spaziati di circa 7-8 nanometri. In molti casi, il microscopio riusciva a risolvere perfettamente questi minuscoli spazi, corrispondendo al design previsto. Tuttavia, hanno anche osservato che a volte i marcatori apparivano distorti o mancanti. Analizzando attentamente i dati, hanno determinato che questi errori non erano dovuti a un difetto della struttura del DNA in sé. Al contrario, i marcatori mancanti erano probabilmente causati dalla superficie a cui il tubo era attaccato, o dall'intensa luce del microscopio che danneggiava i siti di attracco nel tempo. Questa distinzione è stata cruciale, poiché ha dimostrato che il righello di DNA era solido e che gli errori derivavano dalle condizioni sperimentali.

I ricercatori hanno concluso che questi nanotubi di DNA a intelaiatura sono uno strumento versatile e robusto per calibrare i microscopi a super-risoluzione. Sono facili da costruire, richiedendo solo un semplice processo di riscaldamento e raffreddamento per assemblare i filamenti. Sono compatibili con diversi tipi di coloranti fluorescenti e possono essere immagini utilizzando varie configurazioni di microscopi. Soprattutto, forniscono un riferimento affidabile e rigido in grado di misurare distanze su due diverse scale: la spaziatura di 13-14 nanometri tra i segmenti del tubo e la spaziatura di 7-8 nanometri all'interno di un singolo segmento. Offrendo un riferimento semplice, riproducibile e altamente accurato, questi nanotubi di DNA permettono agli scienziati di fidarsi delle loro immagini più che mai, assicurando che i minuscoli dettagli che vedono nel mondo biologico siano reali.