Rigidified and modular wireframe DNA nanotubes as nanorulers to validate super resolution imaging techniques

生細胞の内部にある目に見えない世界を見るために、科学者たちは光の波長よりもはるかに小さな詳細を解像できる顕微鏡を開発してきました。これらの超解像技術は、個々の蛍光分子のオンとオフを切り替え、それらの位置を一つずつ捉え、それらを繋ぎ合わせて鮮明な画像を作成することで機能します。しかし、これらの画像を信頼するためには、研究者は自分たちの装置が正しく測定しているかどうかを確認するための標準的な「定規」を必要とします。大工がノコギリの切り口が正しいか確認するために直定線を必要とするように、科学者も、顕微鏡が真実を見ているかどうかをテストするための、既知の精密な形状を持つ構造体を必要とするのです。長年、そのような定規を作ることは困難でした。なぜなら、使用される材料が、あまりに柔らかすぎたり、構築が難しすぎたり、あるいはラベル付けが一貫して行うには複雑すぎたりしたからです。

マギル大学と欧州分子生物学研究所の研究チームは、今回、すべてDNAで構成された新しい種類の定規を作り出しました。彼らは、わずか4本または5本の短いDNA鎖からなる、硬く中空のチューブを設計しました。彼らが「ワイヤーフレームDNAナノチューブ」と呼ぶこの構造体は、非常に硬く、完全に左右対称であるように作られています。これらのチューブとその小さな個別のセグメントを組み立てることで、チームは、MINFLUXと呼ばれる最先端の技術を含む、最も高度なイメージングシステムの精度を検証できるツールを生み出しました。彼らの研究は、これらのDNAチューブが作りやすいだけでなく、極めて高い精度でその形状を維持しており、7ナノメートルもの微小な距離を測定できる信頼できるベンチマークを提供できることを示しています。

この分野の課題は、既存の標準の多くに欠陥があることです。タンパク質で作られたものは歪む可能性があり、また、複雑な手法を用いて作られるものは、高価で再現が難しいものです。もし定規が曲がっていたり、取り付けられたラベルが緩んでいたりすれば、顕微鏡による測定は誤ったものになってしまいます。研究者たちは、組み立てが単純で、驚くほど硬く、かつラベル付けが容易な構造体を作ることで、この問題を解決しようと考えました。彼らは、ワイヤーフレーム・ナノチューブとして知られるデザインに着目しました。細い柱で作られた足場を想像してください。この場合、柱はDNAの鎖です。チームは、これらの鎖が互いに交差して強い中空のチューブを形成する特定のパターンを使用しました。彼らは、同じ小さなDNAパーツのセットから作られた、三角形、正方形、および五角形の断面を持つバージョンを構築しました。

これらのチューブをイメージングに役立てるために、研究者たちはチューブの側面に小さなドッキングサイトを取り付けました。これらのサイトは、サンプルの周囲の液体中を漂う短い蛍光DNA鎖の「着陸パッド」として機能します。蛍光鎖がドッキングサイトに着陸すると、浮遊して離れる前に一瞬だけ光り、これにより顕微鏡はその正確な位置を記録することができます。ドッキングサイトはチューブを構成するDNA鎖の中に直接組み込まれているため、蛍光マーカーは、測定を狂わせるような緩いコネクターなしに、まさに本来あるべき場所に位置することになります。また、チームはチューブの一端に粘着性のタグを付け、ガラススライドにしっかりと固定することで、イメージング中に構造体が動かないようにしました。

最初のテストは、これらのチューブが定規として十分な硬さを持っているかを確認することでした。研究者たちは、標準的な超解像技術を使用して、チューブの長さに沿った蛍光マーカーの位置をマッピングしました。その結果、チューブは驚くほど真っ直ぐであり、DNAが自然に曲がったりねじれたりする傾向に抵抗していることが分かりました。これら数百のチューブの形状を分析することで、彼らは「持続長（パーシスタンス・レングス）」と呼ばれる硬さの指標を算出しましたが、これは約1.6マイクロメートルでした。これは、チューブが標準的な二重螺旋DNAよりも約30倍から40倍硬いことを意味しており、報告されたDNA構造の中でも最も硬い部類に入ります。この剛性は、チューブが顕微鏡の圧力によって歪むことがなく、測定のための安定した基準となることを裏付けました。

次に、チームはより強力なイメージング手法である「DNA-PAINT MINFLUX」を使用して、技術をさらに推し進めました。この技術は、ドーナツ型の形をしたレーザービームを使用して、従来の方式よりもはるかに少ない光粒子で、単一の分子の位置を極めて精密に特定するものです。彼らがこのシステムでDNAチューブを撮影したところ、結果は驚くべきものでした。顕微鏡は、チューブを構成する個々のセグメント、すなわち「ラング（横桟）」を明確に識別することができました。研究者がこれらのラング間の距離を測定したところ、13から14ナノメートルの間隔であることが分かり、これは理論上の設計および電子顕微鏡による以前の測定値と一致していました。これにより、チューブが硬いだけでなく、完璧な幾何学的精度で組み立てられていることが確認されました。

研究はまた、チューブから単独で取り出して撮影できる「ラング」と呼ばれる個々のセグメントについても調査しました。これらの小さな断片は、より短い距離を測定する顕微鏡の能力をテストする機会を提供しました。研究者たちは、単一のラング内において、蛍光マーカーが約7から8ナノメートルの間隔で配置されていることを見出しました。多くの場合、顕微鏡はこれらの極小の隙間を完璧に解像できましたが、マーカーが歪んで見えたり、あるいは欠落して見えたりする場合もあることが観察されました。データを注意深く分析した結果、これらのエラーはDNA構造自体の欠陥によるものではないことが判明しました。むしろ、欠落したマーカーは、チューブが取り付けられていた表面、あるいは顕微鏡の強烈な光によってドッキングサイトが時間の経過とともに損傷したことによるものである可能性が高いと判断されました。この区別は極めて重要であり、DNAの定規自体は健全であり、エラーは実験条件に起因していることを証明しました。

研究者たちは、これらのワイヤーフレームDNAナノチューブが、超解像顕微鏡を校正するための多用途かつ堅牢なツールであると結論付けました。これらは、ストランドを組み立てるための単純な加熱・冷却プロセスのみを必要とし、構築が容易です。また、さまざまな種類の蛍光色素との互換性があり、様々な顕微鏡セットアップで使用できます。最も重要なことは、これらがチューブのセグメント間の13〜14ナノメートルの間隔と、単一のセグメント内の7〜8ナノメートルの間隔という、2つの異なるスケールにわたって距離を測定できる、信頼できる硬い標準を提供していることです。シンプルで再現性が高く、極めて正確なリファレンスを提供することで、これらのDNAナノチューブは、科学者がこれまで以上に自分の画像を信頼することを可能にし、生物学の世界で見ている微細な詳細が現実のものであることを保証しています。