Rigidified and modular wireframe DNA nanotubes as nanorulers to validate super resolution imaging techniques

살아있는 세포 내부의 보이지 않는 세계를 보기 위해, 과학자들은 빛의 파장보다 훨씬 더 작은 세부 사항까지 분해할 수 있는 현미경을 개발해 왔습니다. 이러한 초고해상도 기술은 개별 형광 분자를 켜고 끄면서, 그 위치를 하나씩 포착한 다음, 이를 하나로 엮어 선명한 이미지를 만드는 방식으로 작동합니다. 그러나 이 이미지들을 신뢰하기 위해서, 연구자들은 자신들의 장비가 정확하게 측정하고 있는지 확인하기 위한 표준 자(ruler)가 필요합니다. 목수가 톱의 절단면이 정확한지 확인하기 위해 직선 자를 필요로 하는 것처럼, 과학자에게는 현미관이 진실을 보고 있는지 테스트할 수 있는, 알려진 정밀한 형태를 가진 구조체가 필요합니다. 수년 동안 그러한 자를 만드는 것은 어려웠는데, 사용된 재료들이 너무 흐물거리거나, 제작하기 너무 어렵거나, 혹은 일관되게 표지(labeling)하기에 너무 복잡했기 때문입니다.

맥길 대학교와 유럽 분자 생물학 연구소(EMBL)의 연구팀은 이제 DNA만으로 만들어진 새로운 종류의 자를 만들어냈습니다. 그들은 단 4개 또는 5개의 짧은 DNA 가닥으로 구성된 단단하고 속이 빈 튜브를 설계했습니다. 그들이 '와이어프레임 DNA 나노튜브(wireframe DNA nanotube)'라고 부르는 이 구조체는 매우 뻣뻣하고 완벽하게 대칭적이도록 설계되었습니다. 이 튜브들과 그보다 작은 개별 조각들을 조립함으로써, 연구팀은 MINFLUX라 불리는 최첨단 기술을 포함한 가장 진보된 이미징 시스템의 정확성을 검증할 수 있는 도구를 만들어냈습니다. 이들의 연구는 이 DNA 튜브가 제작하기 쉬울 뿐만 아니라, 7나노미터만큼 작은 거리까지 측정할 수 있을 정도로 정밀하게 형태를 유지하여, 나노 스케일 이미징의 미래를 위한 신뢰할 수 있는 기준점을 제공한다는 것을 보여줍니다.

이 분야의 과제는 기존의 많은 표준이 결함이 있다는 점입니다. 어떤 것들은 변형될 수 있는 단백질로 만들어졌고, 또 다른 것들은 제작 과정이 복잡하여 비용이 많이 들고 재현하기 어렵습니다. 만약 자가 휘거나 부착된 표지들이 느슨하다면, 현미경이 측정한 값은 틀리게 될 것입니다. 연구자들은 단순하게 조립되면서도 믿을 수 없을 정도로 단단하고, 표지하기 쉬운 구조체를 만듦으로써 이 문제를 해결하고자 했습니다. 그들은 와이어프레임 나노튜브라고 알려진 설계를 채택했습니다. 얇은 기둥들로 만든 비계(scaffold)를 상상해 보십시오. 이 경우 기둥은 DNA 가닥입니다. 연구팀은 이 가닥들이 서로 교차하며 강한 속이 빈 튜브를 형성하는 특정 패턴을 사용했습니다. 그들은 동일한 작은 DNA 조각 세트를 사용하여 삼각형, 사각형, 오각형 단면을 가진 버전들을 제작했습니다.

이 튜브들을 이미징에 유용하게 만들기 위해, 연구자들은 튜브의 측면을 따라 작은 도킹 사이트(docking sites)를 부착했습니다. 이 사이트들은 샘플 주변의 액체 속에 떠다니는 짧은 형광 DNA 가닥들이 착륙하는 착륙장 역할을 합니다. 형광 가닥이 도킹 사이트에 착륙하면 잠시 빛을 낸 후 다시 떠다니게 되며, 이를 통해 현미경은 그 정확한 위치를 기록할 수 있습니다. 도킹 사이트가 튜브를 형성하는 DNA 가닥에 직접 구축되어 있기 때문에, 형광 표지들은 측정값을 흐트러뜨릴 수 있는 느슨한 연결체 없이 정확히 있어야 할 위치에 놓이게 됩니다. 연구팀은 또한 튜브의 한쪽 끝에 끈적한 태그를 추가하여 튜브가 유리 슬라이드에 단단히 부착되어 이미징 과정 동안 움직이지 않도록 했습니다.

첫 번째 테스트는 이 튜브들이 자로서 충분히 뻣뻣한지 확인하는 것이었습니다. 연구자들은 표준 초고해상도 기술을 사용하여 튜브의 길이를 따라 형광 표지들의 위치를 매핑했습니다. 그 결과 튜브는 놀라울 정도로 곧았으며, DNA가 휘거나 뒤틀리려는 자연스러운 경향에 저항한다는 것을 발견했습니다. 수백 개의 튜브 형태를 분석함으로써, 그들은 약 1.6마이크로미터에 달하는 '지속 길이(persistence length)'라는 뻣뻣함의 척도를 계산했습니다. 이는 튜브가 일반적인 이중 가닥 DNA 헬릭스보다 약 30~40배 더 뻣뻣하다는 것을 의미하며, 이는 지금까지 보고된 DNA 구조 중 가장 단단한 축에 속합니다. 이러한 강성은 이 튜브가 현미경의 압력 아래에서도 왜곡되지 않을 것임을 확인시켜 주었으며, 측정에 대한 안정적인 기준을 제공했습니다.

다음으로, 연구팀은 DNA-PAINT MINFLUX라는 더 강력한 이미징 방법을 사용하여 기술을 한 단계 더 밀어붙였습니다. 이 기술은 도넛 모양의 레이저 빔을 사용하여 단일 분자의 위치를 극도로 정밀하게 찾아내며, 전통적인 방식보다 훨씬 적은 양의 빛 입자를 사용합니다. 이 시스템으로 DNA 튜브를 촬영했을 때 결과는 놀라웠습니다. 현미경은 튜브를 구성하는 개별 세그먼트, 즉 '가로대(rungs)'를 명확하게 구분할 수 있었습니다. 연구자들은 이 가로대 사이의 거리를 측정하였고, 그 간격이 13에서 14나노미터임을 발견했습니다. 이는 이론적 설계 및 전자 현미경으로 수행된 이전 측정값과 일치하는 수치였습니다. 이는 튜브가 단단할 뿐만 아니라 완벽한 기하학적 정밀도로 조립되었음을 확인해 주었습니다.

연구는 또한 튜브의 개별 세그로, 즉 격리하여 별도로 촬영할 수 있는 가로대들에 대해서도 조사했습니다. 이 더 작은 조각들은 현미경이 훨씬 더 짧은 거리를 측정할 수 있는 능력을 테스트할 기회를 제공했습니다. 연구자들은 단일 가로대 내에서 형광 표지들이 약 7에서 8나노미터 간격으로 떨어져 있다는 것을 발견했습니다. 많은 경우, 현미경은 이 미세한 틈을 완벽하게 분해해 냈으며, 의도된 설계와 일치했습니다. 그러나 때때로 표지들이 왜곡되거나 누락되어 보이는 현상도 관찰되었습니다. 데이터를 면밀히 분석한 결과, 연구진은 이러한 오류가 DNA 구조 자체의 결함 때문이 아님을 밝혀냈습니다. 대신, 누락된 표지들은 튜브가 부착된 표면의 문제이거나, 현미경의 강한 빛이 시간이 지남에 따라 도킹 사이트를 손상시켰을 가능성이 높았습니다. 이러한 구별은 매우 중요했는데, 이는 DNA 자 자체는 결함이 없으며, 발생하는 오류는 실험 조건에서 비롯된 것임을 증명했기 때문입니다.

연구진은 결론적으로, 이 와이어프레임 DNA 나노튜브가 초고해상도 현미경을 교정하기 위한 다재다능하고 견고한 도구라고 밝혔습니다. 이들은 가닥들을 조립하기 위해 단순한 가열 및 냉각 과정만을 필요로 하므로 제작이 쉽습니다. 또한 다양한 유형의 형광 염료와 호환되며 다양한 현미경 설정에서 촬영할 수 있습니다. 무엇보다도, 이들은 튜브 세그먼트 사이의 1314나노미터 간격과 단일 세그먼트 내의 78나노미터 간격이라는 두 가지 다른 척도에 걸쳐 거리를 측정할 수 있는 신뢰할 수 있고 단단한 표준을 제공합니다. 단순하고 재현 가능하며 매우 정확한 참조 모델을 제공함으로써, 이 DNA 나노튜브는 과학자들이 자신의 이미지를 그 어느 때보다 신뢰할 수 있게 하며, 생물학적 세계에서 보는 미세한 디테일들이 실재함을 보장해 줍니다.