Rigidified and modular wireframe DNA nanotubes as nanorulers to validate super resolution imaging techniques

Para ver o mundo invisível dentro de uma célula viva, os cientistas desenvolveram microscópios que conseguem resolver detalhes muito menores do que o comprimento de onda da luz. Essas técnicas de super-resolução funcionam ligando e desligando moléculas fluorescentes individuais, capturando suas posições uma a uma e, em seguida, costurando-as para formar uma imagem nítida. No entanto, para confiar nessas imagens, os pesquisadores precisam de uma régua padrão para verificar se seus instrumentos estão medindo corretamente. Assim como um carpinteiro precisa de uma régua reta para verificar o corte de uma serra, um cientista precisa de uma estrutura com uma forma conhecida e precisa para testar se o microscópio está vendo a verdade. Durante anos, criar tal régua foi difícil porque os materiais utilizados eram ou muito maleáveis, ou muito difíceis de construir, ou complexos demais para serem rotulados de forma consistente.

Uma equipe de pesquisadores da Universidade McGill e do Laboratório Europeu de Biologia Molecular criou agora um novo tipo de régua feita inteiramente de DNA. Eles projetaram um tubo oco e rígido construído com apenas quatro ou cinco fitas curtas de DNA. Essa estrutura, que chamam de nanotubo de DNA em estrutura de treliça (wireframe), foi construída para ser excepcionalmente rígida e perfeitamente simétrica. Ao montar esses tubos e seus segmentos menores e individuais, a equipe produziu uma ferramenta que pode verificar a precisão dos sistemas de imagem mais avançados, incluindo uma tecnologia de ponta chamada MINFLUX. O trabalho deles demonstra que esses tubos de DNA não são apenas fáceis de fazer, mas também mantêm sua forma com tal precisão que podem medir distâncias tão pequenas quanto sete nanômetros, fornecendo um marco confiável para o futuro da imagem em nanoescala.

O desafio neste campo é que muitos padrões existentes são falhos. Alguns são feitos de proteínas que podem deformar, enquanto outros são construídos usando métodos complexos que os tornam caros e difíceis de reproduzir. Se uma régua entorta ou se os rótulos anexados a ela estão soltos, as medições feitas pelo microscópio estarão erradas. Os pesquisadores quiseram resolver isso criando uma estrutura que fosse simples de montar, incrivelmente rígida e fácil de rotular. Eles recorreram a um design conhecido como nanotubo de treliça. Imagine um andaime feito de postes finos; neste caso, os postes são fitas de DNA. A equipe usou um padrão específico onde essas fitas se cruzam para formar um tubo oco e forte. Eles construíram versões com seções transversais triangulares, quadradas e pentagonais, todas feitas a partir do mesmo pequeno conjunto de peças de DNA.

Para tornar esses tubos úteis para a imagem, os pesquisadores anexaram pequenos locais de ancoragem ao longo das laterais do tubo. Esses locais atuam como plataformas de pouso para fitas curtas de DNA fluorescente que flutuam no líquido ao redor da amostra. Quando uma fita fluorescente pousa em um local de ancoragem, ela brilha brevemente antes de flutuar para longe, permitindo que o microscópio registre sua posição exata. Como os locais de ancoragem são construídos diretamente nas fitas de DNA que formam o tubo, os marcadores fluorescentes ficam exatamente onde deveriam estar, sem quaisquer conectores soltos que possam comprometer a medição. A equipe também adicionou uma etiqueta adesiva em uma extremidade do tubo para que ele se fixasse firmemente a uma lâmina de vidro, garantindo que a estrutura permanecesse imóvel durante o processo de imagem.

O primeiro teste foi para ver se os tubos eram rígidos o suficiente para servir como uma régua. Os pesquisadores usaram uma técnica padrão de super-resolução para mapear as posições dos marcadores fluorescentes ao longo do comprimento dos tubos. Eles descobriram que os tubos eram notavelmente retos, resistindo à tendência natural do DNA de dobrar e torcer. Ao analisar a forma de centenas desses tubos, eles calcularam uma medida de rigidez conhecida como comprimento de persistência, que resultou em aproximadamente 1,6 micrômetros. Isso significa que os tubos são cerca de trinta a quarenta vezes mais rígidos do que uma hélice padrão de DNA de fita dupla, tornando-os entre as estruturas de DNA mais rígidas já relatadas. Essa rigidez confirmou que os tubos não se deformariam sob a pressão do microscópio, fornecendo uma referência estável para as medições.

Em seguida, a equipe levou a tecnologia além, utilizando um método de imagem mais poderoso chamado DNA-PAINT MINFLUX. Esta técnica utiliza um feixe de laser com formato de donut para localizar o local de uma única molécula com extrema precisão, usando muito menos partículas de luz do que os métodos tradicionais. Quando eles imaginaram os tubos de DNA com este sistema, os resultados foram impressionantes. O microscópio conseguiu distinguir claramente os segmentos individuais, ou "degraus", que compunham o tubo. Os pesquisadores mediram a distância entre esses degraus e descobriram que eles estavam espaçados entre 13 e 14 nanômetros, um valor que coincidiu com o design teórico e com medições anteriores feitas com microscópios eletrônicos. Isso confirmou que os tubos não eram apenas rígidos, mas também montados com precisão geométrica perfeita.

O estudo também analisou os segmentos individuais do tubo, conhecidos como degraus, que poderiam ser isolados e imaginados separadamente. Essas peças menores ofereceram uma chance de testar a capacidade do microscópio de medir distâncias ainda menores. Os pesquisadores descobriram que, dentro de um único degrau, os marcadores fluorescentes estavam espaçados cerca de 7 a 8 nanômetros entre si. Em muitos casos, o microscópio conseguiu resolver essas pequenas lacunas perfeitamente, correspondendo ao design pretendido. No entanto, eles também observaram que, às vezes, os marcadores pareciam distorcidos ou ausentes. Ao analisar os dados cuidadosamente, determinaram que esses erros não eram causados pela própria estrutura de DNA sendo falha. Em vez disso, os marcadores ausentes foram provavelmente causados pela superfície à qual o tubo estava anexado, ou pela luz intensa do microscópio danificando os locais de ancoragem ao longo do tempo. Essa distinção foi crucial, pois provou que a régua de DNA em si era sólida, e quaisquer erros vinham das condições experimentais.

Os pesquisadores concluíram que esses nanotubos de DNA em estrutura de treliça são uma ferramenta versátil e robusta para calibrar microscópios de super-resolução. Eles são fáceis de construir, exigindo apenas um processo simples de aquecimento e resfriamento para montar as fitas. São compatíveis com diferentes tipos de corantes fluorescentes e podem ser imaginados usando várias configurações de microscópios. Mais importante ainda, eles fornecem um padrão rígido e confiável que pode medir distâncias em duas escalas diferentes: o espaçamento de 13 a 14 nanômetros entre os segmentos do tubo e o espaçamento de 7 a 8 nanômetros dentro de um único segmento. Ao oferecer uma referência simples, reproduzível e altamente precisa, esses nanotubos de DNA permitem que os cientistas confiem em suas imagens mais do que nunca, garantindo que os minúsculos detalhes que veem no mundo biológico sejam reais.