Two-photon light-sheet live imaging at kilohertz frame rate using birefringence-based pulse splitting

Sintesi Tecnica: Imaging a foglio di luce a due fotoni con frame rate kilohertz tramite divisione degli impulsi basata sulla birifrangenza

Problematica
La microscopia multifotonica è uno standard per l'imaging di tessuti vivi e integri, ma la sua velocità di acquisizione è fondamentalmente limitata dai tassi di emissione dei fluorofori e dalle soglie di fotodanneggiamento. Sebbene gli schemi di acquisizione multipunto e la microscopia a foglio di luce a due fotoni (2P) offrano un'eccitazione parallelizzata per aumentare la velocità, l'ottimizzazione del rapporto segnale-fotodanneggiamento richiede un controllo preciso e indipendente su due parametri critici di illuminazione: la lunghezza d'onda di eccitazione e la frequenza degli impulsi laser. Le sorgenti laser a femtosecondi convenzionali tipicamente mancano della capacità di modulare simultaneamente entrambi i parametri. Nello specifico, l'aumento della frequenza effettiva dei pixel oltre i pochi megahertz (MHz) richiede spesso la riduzione della frequenza di ripetizione degli impulsi per aumentare l'intensità di picco, il che può esacerbare il fotodanneggiamento non lineare e il riscaldamento. Esiste una necessità riconosciuta di strategie a basso costo, efficienti e robuste per modulare il profilo di eccitazione temporale al fine di sfruttare appieno i vantaggi della microscopia a foglio di luce 2P per l'imaging in vivo ad alta velocità.

Metodologia
Gli autori introducono uno schema di divisione degli impulsi compatto e passivo basato su cristalli birifrangenti in cascata per affrontare queste limitazioni. Il nucleo della metodologia prevede:

1. Meccanismo di divisione degli impulsi: Il sistema utilizza due cristalli birifrangenti di Yttrium Orthovanadate ($YVO_4$) ($BC1$e$BC2$) con spessori specifici (10 mm e 20 mm), una lamina a mezz'onda (HWP) e un polarizzatore lineare. Ruotando gli assi ottici (OA) dei cristalli e la HWP, un singolo impulso laser viene convertito in una sequenza regolabile di 1, 2 o 4 sub-impulsi collineari.

   • Configurazione 1 (Nessuna divisione): Gli angoli OA a $0^\circ$ risultano in un singolo impulso.
   • Configurazione 2 (Divisione 2$\times$): Ruotando il secondo cristallo e la HWP a $45^\circ$, la frequenza degli impulsi raddoppia.
   • Configurazione 3 (Divisione 2$\times$2$\times$): Impostando il primo cristallo a $45^\circ$, il secondo a $0^\circ$ e la HWP a $22,5^\circ$, la frequenza degli impulsi quadruplica.
   • I sub-impulsi sono separati da ritardi di picosecondi (7,6 ps e 15,2 ps per i rispettivi spessori dei cristalli) e possiedono polarizzazioni lineari alternate.

2. Setup Ottico: Il divisore di impulsi è integrato in un microscopio a foglio di luce 2P. Il sistema impiega una sorgente laser sintonizzabile in lunghezza d'onda (Satsuma a 1030 nm o Opera a 1070 nm). Il fascio passa attraverso l'unità di divisione degli impulsi, un modulatore elettro-ottico (EOM) e specchi galvanometrici per la scansione. L'illuminazione è fornita da un obiettivo a immersione in acqua da 10X, mentre la rilevazione avviene ortogonalmente tramite un obiettivo da 25X e una telecamera qCMOS.

3. Ottimizzazione dei Parametri: Gli autori hanno ottimizzato i parametri di imaging per i fluorofori rossi (mCherry e jRGECO1b) in embrioni di zebrafish vivi. In base agli spettri di assorbimento dell'acqua e all'assorbimento 2P di mCherry, è stato selezionato 1070 nm per minimizzare il riscaldamento lineare massimizzando al contempo l'eccitazione. Utilizzando le leggi di scala per il fotodanneggiamento non lineare, è stata predetta una frequenza media di impulso target di 16 MHz per ottimizzare il compromesso tra segnale, riscaldamento e fotodanneggiamento. La sorgente laser da 4 MHz è stata up-convertita a 16 MHz utilizzando la configurazione di divisione 2$\times$2$\times$.

Risultati Chiave
Lo studio valida l'approccio di divisione degli impulsi attraverso una caratterizzazione estesa e l'imaging in vivo:

• Qualità dell'immagine e Risoluzione: Lo schema di divisione degli impulsi non ha degradato la risoluzione spaziale. Le misurazioni della Funzione di Diffusione del Punto (PSF) hanno mostrato una larghezza a metà altezza (FWHM) assiale costante di circa 3,5 $\mu$m in tutte le configurazioni (nessuna divisione, 2$\times$, e 2$\times$2$\times$).
• Segnale e Fotodecolorazione: L'intensità del segnale di fluorescenza eccitata a due fotoni (2PEF) è stata comparabile tra i laser ad alta frequenza convenzionali e le configurazioni a impulsi divisi (ad esempio, 8 MHz vs 2$\times$2$\times$2 MHz). Fondamentalmente, i tassi di fotodecolorazione non sono aumentati significativamente dai ritardi degli impulsi in picosecondi, confermando che i brevi intervalli tra gli impulsi non saturano il tempo di vita della fluorescenza né accelerano la decolorazione.
• Danneggiamento Termico e Non Lineare:
  • Riscaldamento: Spostare la lunghezza d'onda di eccitazione da 1030 nm a 1070 nm ha ridotto la variazione della frequenza cardiaca (HBR, un proxy del riscaldamento) di un fattore di 0,68, in correlazione con la ridotta assorbimento dell'acqua.
  • Danneggiamento Non Lineare: La soglia di fotodanneggiamento non lineare ($P_{NL}$) si è rivelata indipendente dal fatto che gli impulsi fossero distribuiti uniformemente o consegnati in burst con ritardi di picosecondi. La soglia seguiva le leggi di scala attese con la frequenza degli impulsi, sebbene sia stato osservato un leggero spostamento verso l'alto (circa il 40% più alto) per la configurazione 2$\times$2$\times$, potenzialmente dovuto a un minore spostamento spaziale delle componenti di polarizzazione.
• Prestazioni di Imaging ad Alta Velocità:
  • Imaging del Cuore: Utilizzando l'illuminazione a 1070 nm e una frequenza di impulso effettiva di 16 MHz (110 mW di potenza media, 0,1 TW$\cdot$cm$^{-2}$ di intensità di picco), gli autori hanno ottenuto l'imaging volumetrico del cuore battente di zebrafish a 1052 Hz (scansione bi-direzionale) e 465 Hz (scansione forward). Ciò corrisponde a tassi di pixel superiori a 150 MHz (fino a 163 MHz), un ordine di grandezza superiore alla frequenza della sorgente laser (4 MHz).
  • Neuroscienze: Il sistema ha catturato con successo la dinamica spontanea del calcio neuronale utilizzando l'indicatore rosso jRGECO1b a una frequenza di frame di 465 Hz (frequenza di pixel di 165 MHz).
  • Livelli di Segnale: Nonostante l'alta velocità, il sistema ha mantenuto livelli di segnale superiori a 10 fotoni$\cdot$pixel$^{-1}$ (circa 9–10 elettroni$\cdot$pixel$^{-1}$) con un rapporto segnale-fondo di ~10. La fotodecolorazione è rimasta limitata, con diminuzioni del segnale solo del 18–34% dopo l'acquisizione di migliaia di frame.

Significatività e Rivendicazioni
L'articolo afferma che lo schema di divisione degli impulsi basato sulla birifrangenza offre un metodo compatto, a basso costo e robusto per modulare il profilo di illuminazione temporale nella microscopia multifotonica. La sua principale significatività risiede nel consentire l'imaging a foglio di luce a due fotoni con frame rate kilohertz e con frequenze di pixel nell'ordine dei megahertz, senza compromettere la qualità dell'immagine o aumentare significativamente il fotodanneggiamento.

I principali vantaggi evidenziati dagli autori includono:

1. Decoupling dei Parametri: Permette l'ottimizzazione indipendente della lunghezza d'onda (per riscaldamento e assorbimento) e della frequenza di impulso effettiva (per segnale e danno non lineare) utilizzando una sorgente laser a frequenza di ripetizione fissa.
2. Efficienza: Il sistema è quasi privo di perdite (a meno che non sia richiesto strettamente un polarizzatore per il controllo della polarizzazione) e non richiede complessi processi di ricombinazione o allineamento del fascio, poiché i fasci in uscita rimangono intrinsecamente collineari.
3. Prestazioni: Raggiunge frequenze di pixel (fino a 165 MHz) che superano di gran lunga la frequenza degli impulsi del laser (4 MHz), una capacità non possibile nella microscopia a scansione puntiforme dove è richiesto almeno un impulso per ogni pixel.
4. Vitalità Biologica: Il metodo facilita l'imaging in vivo ad alta velocità di processi biologici rapidi (battito cardiaco, dinamiche del calcio) in embrioni di zebrafish vivi, mantenendo la risoluzione subcellulare, il riscaldamento del campione sotto 1°C e una bassa fotodecolorazione.

Gli autori concludono che questa strategia ottimizza efficacemente il rapporto segnale-fotodanneggiamento, rendendola una soluzione valida per far avanzare l'imaging a due fotoni veloce in vivo.