Two-photon light-sheet live imaging at kilohertz frame rate using birefringence-based pulse splitting

Résumé technique : Imagerie à feuille de lumière à deux photons en mode live à une fréquence d'image de l'ordre du kilohertz par division de impulsions basée sur la biréfringence

Énoncé du problème
La microscopie multiphotonique est une norme pour l'imagerie de tissus vivants et intacts, mais sa vitesse d'imagerie est fondamentalement contrainte par les taux d'émission des fluorophores et les seuils de photodégradation. Bien que les schémas d'acquisition multipoints et la microscopie à feuille de lumière à deux photons (2P) offrent une excitation parallélisée pour augmenter la vitesse, l'optimisation du rapport signal/photodégradation nécessite un contrôle précis et indépendant de deux paramètres d'illumination critiques : la longueur d'onde d'excitation et la fréquence d'impulsion laser. Les sources laser femtosecondes conventionnelles manquent généralement de la capacité de modulation simultanée de ces deux paramètres. Plus précisément, augmenter le taux de pixels effectif au-delà de quelques mégahertz (MHz) nécessite souvent de réduire le taux de répétition des impulsions pour augmenter l'intensité de crête, ce qui peut exacerber la photodégradation non linéaire et l'échauffement. Il existe un besoin reconnu pour des stratégies à faible coût, efficaces et robustes afin de moduler le profil d'excitation temporelle pour exploiter pleinement les avantages de la microscopie à feuille de lumière 2P pour l'imagerie in vivo à haute vitesse.

Méthodologie
Les auteurs présentent un schéma compact et passif de division d'impulsions basé sur des cristaux biréfringents en cascade pour répondre à ces limitations. Le cœur de la méthodologie repose sur :

1. Mécanisme de division d'impulsions : Le système utilise deux cristaux biréfringents de Yttrium Orthovanadate ($YVO_4$) ($BC1$ et $BC2$) avec des épaisseurs spécifiques (10 mm et 20 mm), une lame demi-onde (HWP) et un polariseur linéaire. En faisant pivoter les axes optiques (OA) des cristaux et la HWP, une seule impulsion laser est convertie en une séquence ajustable de 1, 2 ou 4 sous-impulsions colinéaires.

   • Configuration 1 (Pas de division) : Les angles d'OA à $0^\circ$ résultent en une seule impulsion.
   • Configuration 2 (Division $\times$2) : La rotation du second cristal et de la HWP à $45^\circ$ double la fréquence des impulsions.
   • Configuration 3 (Division $\times$2$\times$2) : Le réglage du premier cristal à $45^\circ$, du second à $0^\circ$ et de la HWP à $22,5^\circ$ quadruple la fréquence des impulsions.
   • Les sous-impulsions sont séparées par des délais de l'ordre de la picoseconde (7,6 ps et 15,2 ps pour les épaisseurs de cristaux respectives) et possèdent des polarisations linéaires alternées.

2. Configuration optique : Le diviseur d'impulsions est intégré dans un microscope à feuille de lumière 2P. Le système emploie une source laser accordable en longueur d'onde (Satsuma à 1030 nm ou Opera à 1070 nm). Le faisceau passe par l'unité de division d'impulsions, un modulateur électro-optique (EOM) et des miroirs galvanométriques pour le balayage. L'illumination est délivrée via un objectif à immersion dans l'eau de 10X, tandis que la détection est effectuée orthogonalement à l'aide d'un objectif de 25X et d'une caméra qCMOS.

3. Optimisation des paramètres : Les auteurs ont optimisé les paramètres d'imagerie pour les fluorophores rouges (mCherry et jRGECO1b) dans des embryons de zebrafish vivants. Sur la base des spectres d'absorption de l'eau et de l'absorption 2P de mCherry, 1070 nm a été choisi pour minimiser l'échauffement linéaire tout en maximisant l'excitation. En utilisant les lois d'échelle pour la photodégradation non linéaire, une fréquence d'impulsion moyenne cible de 16 MHz a été prédite pour optimiser le compromis entre signal, échauffement et photodégradation. Le laser source de 4 MHz est sur-converti à 16 MHz en utilisant la configuration de division $\times$2$\times$2.

Résultats clés
L'étude valide l'approche de division d'impulsions par une caractérisation étendue et une imagerie in vivo :

• Qualité d'image et résolution : Le schéma de division d'impulsions n'a pas dégradé la résolution spatiale. Les mesures de la fonction d'étalement du point (PSF) ont montré une largeur à mi-hauteur (FWHM) axiale constante d'environ 3,5 $\mu$m à travers toutes les configurations (pas de division, $\times$2, et $\times$2$\times$2).
• Signal et photoblanchiment : L'intensité du signal de fluorescence excitée à deux photons (2PEF) était comparable entre les lasers à haute fréquence conventionnels et les configurations à impulsions divisées (par exemple, 8 MHz contre 2$\times$2$\times$2 MHz). Crucialement, les taux de photoblanchiment n'ont pas été significativement augmentés par les délais d'impulsion de l'ordre de la picoseconde, confirmant que les intervalles inter-impulsions courts ne saturent pas la durée de vie de la fluorescence ni n'accélèrent le blanchiment.
• Dommages thermiques et non linéaires :
  • Échauffement : Le déplacement de la longueur d'onde d'excitation de 1030 nm à 1070 nm a réduit la variation du rythme cardiaque (HBR) (un indicateur de l'échauffement) d'un facteur 0,68, corrélant avec une réduction de l'absorption de l'eau.
  • Dommages non linéaires : Le seuil de photodégradation non linéaire ($P_{NL}$) s'est avéré indépendant du fait que les impulsions soient réparties uniformément ou délivrées en rafales avec des délais de la picoseconde. Le seuil suit les lois d'échelle attendues avec la fréquence d'impulsion, bien qu'un léger décalage vers le haut (environ 40 % de plus) ait été observé pour la configuration $\times$2$\times$2, potentiellement dû à un léger déplacement spatial des composantes de polarisation.
• Performance d'imagerie à haute vitesse :
  • Imagerie cardiaque : En utilisant l'illumination à 1070 nm et une fréquence d'impulsion effective de 16 MHz (110 mW de puissance moyenne, 0,1 TW$\cdot$cm$^{-2}$ d'intensité de crête), les auteurs ont réalisé l'imagerie volumétrique du cœur battant de zebrafish à 1052 Hz (balayage bidirectionnel) et 465 Hz (balayage unidirectionnel). Cela correspond à des taux de pixels dépassant 150 MHz (jusqu'à 163 MHz), soit un ordre de grandeur supérieur à la fréquence de la source laser (4 MHz).
  • Neurosciences : Le système a capturé avec succès la dynamique calcique neuronale spontanée en utilisant l'indicateur rouge jRGECO1b à une fréquence d'image de 465 Hz (taux de pixels de 165 MHz).
  • Niveaux de signal : Malgré la haute vitesse, le système a maintenu des niveaux de signal supérieurs à 10 photons$\cdot$pixel$^{-1}$ (environ 9–10 électrons$\cdot$pixel$^{-1}$) avec un rapport signal sur bruit d'environ 10. Le photoblanchiment est resté limité, avec des diminutions de signal de seulement 18–34 % après l'acquisition de milliers de cadres.

Signification et revendications
L'article affirme que le schéma de division d'impulsions par biréfringence proposé offre une méthode compacte, à faible coût et robuste pour moduler le profil d'illumination temporelle en microscopie multiphotonique. Sa principale signification réside dans la possibilité de réaliser une imagerie à feuille de lumière 2P à des fréquences d'image de l'ordre du kilohertz avec des taux de pixels de l'ordre du mégahertz sans compromettre la qualité d'image ni augmenter significativement la photodégradation.

Les principaux avantages mis en évidence par les auteurs incluent :

1. Découplage des paramètres : Il permet une optimisation indépendante de la longueur d'onde (pour l'échauffement et l'absorption) et de la fréquence d'impulsion effective (pour le signal et la photodégradation non linéaire) en utilisant une source laser à fréquence de répétition fixe.
   2.Efficacité : Le système est presque sans perte (à moins qu'un polariseur ne soit strictement requis pour le contrôle de la polarisation) et ne nécessite aucune recombinaison ou alignement complexe de faisceaux, car les faisceaux de sortie restent intrinsèquement colinéaires.
2. Performance : Il atteint des taux de pixels (jusqu'à 165 MHz) qui dépassent largement la fréquence d'impulsion du laser (4 MHz), une capacité impossible en microscopie à balayage ponctuel où au moins une impulsion est requise par pixel.
3. Viabilité biologique : La méthode facilite l'imagerie in vivo à haute vitesse de processus biologiques rapides (battements cardiaques, dynamique calcique) dans des embryons de zebrafish vivants, avec une résolution subcellulaire, tout en maintenant l'échauffement de l'échantillon en dessous de 1°C et en limitant le photoblanchiment.

Les auteurs concluent que cette stratégie optimise efficacement le rapport signal/photodégradation, ce qui en fait une solution viable pour faire progresser l'imagerie rapide à deux photons in vivo.