Two-photon light-sheet live imaging at kilohertz frame rate using birefringence-based pulse splitting

Technische Samenvatting: Twee-fotonen lichtveldsysteem voor live-imaging met een kilohertz frame rate middels birefringente puls-splitting

Probleemstelling
Multiphoton-microscopie is een standaard voor het beeldvormen van levend, intact weefsel, maar de snelheid van beeldvorming wordt fundamenteel beperkt door de emissiesnelheden van fluoroforen en fotodamage-drempels. Hoewel multipunt-acquisitieschema's en twee-foton (2P) lichtveldmicroscopie (light-sheet microscopy) geparallelliseerde excitatie bieden om de snelheid te verhogen, vereist het optimaliseren van de signaal-fotodamage-ratio precieze, onafhankelijke controle over twee kritische verlichtingsparameters: de excitatiegolflengte en de laserpulsfrequentie. Conventionele femtoseconde laserbronnen missen doorgaans de instelbaarheid om beide parameters simultaan te moduleren. Specifiek, het verhogen van de effectieve pixelrate boven enkele megahertz (MHz) vereist vaak het verlagen van de puls-repetitierate om de piekindensiteit te verhogen, wat de niet-lineaire fotodamage en opwarming kan verergeren. Er is een erkende behoefte aan goedkope, efficiënte en robuuste strategieën om het temporele excitatieprofiel te moduleren om de voordelen van 2P lichtveldmicroscopie voor snelle in vivo beeldvorming volledig te benutten.

Methodologie
De auteurs introduceren een compact, passief puls-splitsingsschema gebaseerd op gekascadeerde birefringente kristallen om deze beperkingen aan te pakken. De kern van de methodologie omvat:

1. Puls-splitsingsmechanisme: Het systeem maakt gebruik van twee Yttrium Orthovanadaat ($YVO_4$) birefringente kristallen ($BC1$ en $BC2$) met specifieke diktes (10 mm en 20 mm), een halfgolfplaat (HWP) en een lineaire polarisator. Door de optische assen (OA) van de kristallen en de HWP te roteren, wordt een enkele invoerlaserpuls omgezet in een aanpasbare sequentie van 1, 2 of 4 collineaire sub-pulsen.

   • Configuratie 1 (Geen splitting): OA-hoeken van $0^\circ$ resulteren in een enkele puls.
   • Configuratie 2 (2$\times$ splitting): Het roteren van het tweede kristal en de HWP naar $45^\circ$ verdubbelt de pulsfrequentie.
   • Configuratie 3 (2$\times$2$\times$ splitting): Het instellen van de eerste kristal op $45^\circ$, de tweede op $0^\circ$ en de HWP op $22,5^\circ$ verviervoudigt de pulsfrequentie.
   • De sub-pulsen zijn gescheiden door picoseconde vertragingen (7,6 ps en 15,2 ps voor de respectievelijke kristaldiktes) en bezitten alternerende lineaire polarisaties.

2. Optische Opstelling: De puls-splitter is geïntegreerd in een 2P lichtveld-microscoop. Het systeem gebruikt een golflengte-instelbare laserbron (Satsuma bij 1030 nm of Opera bij 1070 nm). De straal gaat door de puls-splitsingseenheid, een elektro-optische modulator (EOM) en galvanometrische spiegels voor scannen. De verlichting wordt geleverd via een 10X water-dipping objectief, terwijl detectie orthogonaal plaatsvindt met een 25X objectief en een qCMOS-camera.

3. Parameteroptimalisatie: De auteurs optimaliseerden de beeldvormingsparameters voor rode fluoroforen (mCherry en jRGECO1b) in levende zebravis-embryo's. Op basis van de waterabsorptiespectra en de mCherry 2P-absorptie werd 1070 nm gekozen om lineaire opwarming te minimaliseren en excitatie te maximaliseren. Gebruikmakend van schaalwetten voor niet-lineaire fotodamage, werd een doelgemiddelde pulsfrequentie van 16 MHz voorspeld om de afweging tussen signaal, opwarming en fotodamage te optimaliseren. De 4 MHz bronlaser werd ge-upconverted naar 16 MHz met behulp van de 2$\times$2$\times$ splitting configuratie.

Belangrijkste Resultaten
De studie valideert de puls-splitsingsbenadering door uitgebreide karakterisering en in vivo beeldvorming:

• Beeldkwaliteit en Resolutie: Het puls-splitsingsschema degradeerde de ruimtelijke resolutie niet. Point Spread Function (PSF) metingen toonden een consistente axiale FWHM van ongeveer 3,5 $\mu$m over alle configuraties (geen splitting, 2$\times$, en 2$\times$2$\times$).
• Signaal en Fotobleken: De 2-foton geëxciteerde fluorescentie (2PEF) signaalintensiteit was vergelijkbaar tussen conventionele hoogfrequente lasers en de split-pulse configuraties (bijv. 8 MHz vs. 2$\times$2$\times$2 MHz). Cruciaal is dat de fotobleken-snelheden niet significant werden verhoogd door de picoseconde puls-vertragingen, wat bevestigt dat de korte intervallen tussen pulsen de fluorescentie-levensduur niet verzadigen of het bleken versnellen.
• Thermische en Niet-lineaire Fotodamage:
  • Opwarming: Het verschuiven van de excitatiegolflengte van 1030 nm naar 1070 nm verminderde de variatie in hartslagfrequentie (HBR) (een proxy voor opwarming) met een factor 0,68, wat correleert met verminderde waterabsorptie.
  • Niet-lineaire schade: De niet-lineaire fotodamage-drempel ($P_{NL}$) bleek onafhankelijk van of de pulsen gelijkmatig verdeeld waren of in bursts werden geleverd met picoseconde vertragingen. De drempel volgde de verwachte schaalwetten met de pulsfrequentie, hoewel een lichte opwaartse verschuiving (ongeveer 40% hoger) werd waargenomen voor de 2$\times$2$\times$ configuratie, mogelijk door een kleine ruimtelijke verplaatsing van de polarisatiecomponenten.
• Hoge Snelheid Beeldvormingsprestaties:
  • Hart-beeldvorming: Door gebruik te maken van 1070 nm verlichting en een 16 MHz effectieve pulsfrequentie (110 mW gemiddeld vermogen, 0,1 TW$\cdot$cm$^{-2}$ piekindensiteit), bereikten de auteurs volumetrische beeldvorming van het kloppende zebravishart bij 1052 Hz (bi-directioneel scannen) en 465 Hz (forward scannen). Dit komt overeen met pixelrates die de 150 MHz overstijgen (tot 163 MHz), een orde van grootte hoger dan de laserbronfrequentie (4 MHz).
  • Neuroscience: Het systeem legde succesvol spontane neuronale calciumdynamiek vast met de rode indicator jRGECO1b bij een frame rate van 465 Hz (165 MHz pixelrate).
  • Signaalniveaus: Ondanks de hoge snelheid behield het systeem signaalniveaus boven de 10 fotonen$\cdot$pixel$^{-1}$ (ongeveer 9–10 elektronen$\cdot$pixel$^{-1}$) met een signaal-achtergrondverhouding van ~10. Fotobleken bleef beperkt, met signaalafnames van slechts 18–34% na het acquireren van duizenden frames.

Betekenis en Claims
Het artikel beweert dat de voorgestelde op basis van birefringentie van de puls-splitsingsmethode een compacte, goedkope en robuuste methode biedt om het temporele verlichtingsprofiel in multiphoton-microscopie te moduleren. De primaire betekenis ligt in het mogelijk maken van kilohertz frame rate 2P lichtveld-beeldvorming met megahertz-schaal pixelrates zonder de beeldkwaliteit te compromitteren of de fotodamage aanzienlijk te verhogen.

De belangrijkste voordelen die door de auteurs worden benadrukt zijn:

1. Ontkoppeling van Parameters: Het maakt onafhankelijke optimalisatie van golflengte (voor opwarming en absorptie) en effectieve pulsfrequentie (voor signaal en niet-lineaire schade) mogelijk met een laserbron met een vaste herhalingsfrequentie.
2. Efficiëntie: Het systeem is bijna verliesvrij (tenzij een polarisator strikt vereist is voor polarisatiecontrole) en vereist geen complexe bundelrecombinatie of uitlijning, aangezien de uitvoerbundels inherent collineair blijven.
3. Prestaties: Het bereikt pixelrates (tot 165 MHz) die de laserpulsfrequentie (4 MHz) ver overstijgen, een capaciteit die niet mogelijk is in punt-scannende microscopie waar ten minste één puls per pixel vereist is.
4. Biologische Leefbaarheid: De methode faciliteert snelle in vivo beeldvorming van snelle biologische processen (hartslag, calciumdynamiek) in levende zebravis-embryo's met subcellulaire resolutie, terwijl de monsteropwarming onder de 1°C blijft en fotobleken beperkt blijft.

De auteurs concluderen dat deze strategie effectief de signaal-fotodamage-ratio optimaliseert, waardoor het een levensvatbare oplossing vormt voor de vooruitgang van snelle in vivo twee-foton beeldvorming.