Two-photon light-sheet live imaging at kilohertz frame rate using birefringence-based pulse splitting

Resumo Técnico: Imagem de folha de luz de dois fótons em tempo real com taxa de quadros de quilohertz usando divisão de pulso baseada em birrefringência

Definição do Problema
A microscopia multifotônica é um padrão para a imagem de tecidos vivos e intactos, mas sua velocidade de imagem é fundamentalmente limitada pelas taxas de emissão de fluoróforos e pelos limiares de fotodano. Embora esquemas de aquisição multiponto e a microscopia de folha de luz de dois fótons (2P) ofereçam excitação paralelizada para aumentar a velocidade, a otimização da razão sinal-fotodano requer o controle preciso e independente de dois parâmetros críticos de iluminação: o comprimento de onda de excitação e a frequência do pulso de laser. Fontes de laser de femtossegundo convencionais normalmente carecem da sintonizabilidade para modular ambos os parâmetros simultaneamente. Especificamente, aumentar a taxa de pixel efetiva além de alguns megahertz (MHz) frequentemente exige a redução da taxa de repetição de pulso para aumentar a intensidade de pico, o que pode exacerbar o fotodano não linear e o aquecimento. Há uma necessidade reconhecida de estratégias de baixo custo, eficientes e robustas para modular o perfil de excitação temporal para explorar plenamente as vantagens da microscopia de folha de luz 2P para imagem in vivo de alta velocidade.

Metodologia
Os autores introduzem um esquema compacto e passivo de divisão de pulso baseado em cristais birrefringentes em cascata para abordar essas limitações. O núcleo da metodologia envolve:

1. Mecanismo de Divisão de Pulso: O sistema utiliza dois cristais birrefringentes de ortovanadato de ítrio ($YVO_4$) ($BC1$e$BC2$) com espessuras específicas (10 mm e 20 mm), uma placa de meia onda (HWP) e um polarizador linear. Ao rotacionar os eixos ópticos (OA) dos cristais e a HWP, um único pulso laser é convertido em uma sequência ajustável de 1, 2 ou 4 sub-pulsos colineares.

   • Configuração 1 (Sem divisão): Ângulos de OA em $0^\circ$ resultam em um único pulso.
   • Configuração 2 (Divisão 2$\times$): Rotacionar o segundo cristal e a HWP para $45^\circ$ dobra a frequência de pulso.
   • Configuração 3 (Divisão 2$\times$2$\times$): Definir o primeiro cristal para $45^\circ$, o segundo para $0^\circ$ e a HWP para $22,5^\circ$ quadruplica a frequência de pulso.
   • Os sub-pulsos são separados por atrasos de picossegundos (7,6 ps e 15,2 ps para as respectivas espessuras de cristal) e possuem polarizações lineares alternadas.

2. Configuração Óptica: O divisor de pulso é integrado a um microscópio de folha de luz 2P. O sistema emprega uma fonte de laser sintonizável em comprimento de onda (Satsuma a 1030 nm ou Opera a 1070 nm). O feixe passa pela unidade de divisão de pulso, um modulador eletro-óptico (EOM) e espelhos galvanométricos para varredura. A iluminação é entregue via um objetivo de imersão em água de 10X, enquanto a detecção é realizada ortogonalmente usando um objetivo de 25X e uma câmera qCMOS.

3. Otimização de Parâmetros: Os autores otimizaram os parâmetros de imagem para fluoróforos vermelhos (mCherry e jRGECO1b) em embriões de zebrafish vivos. Com base nos espectros de absorção de água e na absorção 2P de mCherry, 1070 nm foi selecionado para minimizar o aquecimento linear enquanto maximiza a excitação. Usando leis de escala para fotodano não linear, previu-se uma frequência de pulso média alvo de 16 MHz para otimizar o equilíbrio entre sinal, aquecimento e fotodano. A fonte de laser de 4 MHz foi up-convertida para 16 MHz usando a configuração de divisão 2$\times$2$\times$.

Principais Resultados
O estudo valida a abordagem de divisão de pulso através de uma caracterização extensiva e imagem in vivo:

• Qualidade de Imagem e Resolução: O esquema de divisão de pulso não degradou a resolução espacial. Medições da Função de Espalhamento de Ponto (PSF) mostraram uma largura total à meia altura (FWHM) axial consistente de aproximadamente 3,5 $\mu$m em todas as configurações (sem divisão, 2$\times$ e 2$\times$2$\times$).
• Sinal e Fotodescoloração: A intensidade do sinal de fluorescência excitada por dois fótons (2PEF) foi comparável entre lasers de alta frequência convencionais e as configurações de pulso dividido (ex: 8 MHz vs. 2$\times$2$\times$2 MHz). Crucialmente, as taxas de fotodescoloração não foram significativamente aumentadas pelos atrasos de pulso de picossegundos, confirmando que os curtos intervalos entre pulsos não saturam o tempo de vida da fluorescência ou aceleram a descoloração.
• Dano Térmico e Não Linear:
  • Aquecimento: Deslocar o comprimento de onda de excitação de 1030 nm para 1070 nm reduziu a variação da frequência cardíaca (HBR) (um proxy para aquecimento) em um fator de 0,68, correlacionando-se com a redução da absorção de água.
  • Dano Não Linear: O limiar de fotodano não linear ($P_{NL}$) mostrou-se independente de se os pulsos eram distribuídos uniformemente ou entregues em rajadas com atrasos de picossegundos. O limiar seguiu as leis de escala esperadas com a frequência de pulso, embora um leve deslocamento ascendente (aprox. 40% maior) tenha sido observado para a configuração 2$\times$2$\times$, potencialmente devido ao pequeno deslocamento espacial dos componentes de polarização.
• Desempenho de Imagem de Alta Velocidade:
  • Imagem de Coração: Usando iluminação de 1070 nm e uma frequência de pulso efetiva de 16 MHz (110 mW de potência média, 0,1 TW$\cdot$cm$^{-2}$ de intensidade de pico), os autores alcançaram a imagem volumétrica do coração de zebrafish batendo a 1052 Hz (varredura bidirecional) e 465 Hz (varredura direta). Isso corresponde a taxas de pixel superiores a 150 MHz (até 163 MHz), um fator de ordem de grandeza superior à frequência da fonte de laser (4 MHz).
  • Neurociência: O sistema capturou com sucesso a dinâmica espontânea de cálcio neuronal usando o indicador vermelho jRGECO1b a uma taxa de quadro de 465 Hz (taxa de pixel de 165 MHz).
  • Níveis de Sinal: Apesar da alta velocidade, o sistema manteve níveis de sinal acima de 10 fótons$\cdot$pixel$^{-1}$ (aprox. 9–10 elétrons$\cdot$pixel$^{-1}$) com uma razão sinal-fundo de ~10. A fotodescoloração permaneceu limitada, com reduções de sinal de apenas 18–34% após a aquisição de milhares de quadros.

Significância e Alegações
O artigo afirma que o esquema de divisão de pulso baseado em birrefringência proposto oferece um método compacto, de baixo custo e robusto para modular o perfil de iluminação temporal em microscopia de múltiplos fótons. Sua principal significância reside em permitir a imagem de folha de luz de dois fótons com taxa de quadros de quilohertz com taxas de pixel na escala de megahertz sem comprometer a qualidade da imagem ou aumentar significativamente o fotodano.

As principais vantagens destacadas pelos autores incluem:

1. Desacoplamento de Parâmetros: Permite a otimização independente do comprimento de onda (para aquecimento e absorção) e da frequência de pulso efetiva (para sinal e dano não linear) usando uma fonte de laser de frequência de repetição fixa.
2. Eficiência: O sistema é quase sem perdas (a menos que um polarizador seja estritamente necessário para o controle de polarização) e não requer recombinação ou alinhamento complexo de feixes, pois os feixes de saída permanecem inerentemente colineares.
3. Desempenho: Alcança taxas de pixel (até 165 MHz) que excedem vastamente a frequência do pulso do laser (4 MHz), uma capacidade impossível na microscopia de varredura de ponto, onde pelo menos um pulso é necessário por pixel.
4. Viabilidade Biológica: O método facilita a imagem in vivo de alta velocidade de processos biológicos rápidos (batimento cardíaco, dinâmica de cálcio) em embriões de zebrafish vivos com resolução subcelular, mantendo o aquecimento da amostra abaixo de 1°C e mantendo a fotodescoloração baixa.

Os autores concluem que esta estratégia efetivamente otimiza a razão sinal-fotodano, tornando-a uma solução viável para o avanço da imagem de dois fótons rápida in vivo.