Two-photon light-sheet live imaging at kilohertz frame rate using birefringence-based pulse splitting

기술 요약: 복굴절 기반 펄스 분할을 이용한 킬로헤르츠 프레임 레이트의 이광자 라이트 시트 실시간 이미징

문제 정의
다광자 현미경은 살아있는 온전한 조직을 이미징하는 표준 기술이지만, 형광체의 발광 속도와 광손상 임계값에 의해 이미징 속도가 근본적으로 제한됩니다. 다지점 획득 방식과 이광자(2P) 라이트 시트 현미경은 속도를 높이기 위해 병렬화된 여기(excitation)를 제공하지만, 신호 대 광손상 비율을 최적화하려면 두 가지 핵심 조명 파라미터인 여기 파장과 레이저 펄스 주파수를 정밀하고 독립적으로 제어해야 합니다. 기존의 펨토초 레이저 소스는 일반적으로 이 두 파라미터를 동시에 조절할 수 있는 튜너빌리티(tunability)가 부족합니다. 특히, 유효 픽셀 레이트를 몇 메가헤르츠(MHz) 이상으로 높이려면 피크 강도를 높이기 위해 펄스 반복률을 줄여야 하는 경우가 많은데, 이는 비선형 광손상과 가열을 악화시킬 수 있습니다. 고속 생체 내(in vivo) 이미징을 위해 이광자 라이트 시트 현미경의 장점을 완전히 활용할 수 있도록 시간적 여기 프로파일을 변조하는 저비용, 고효율, 견고한 전략이 필요합니다.

방법론
저자들은 이러한 한계를 해결하기 위해 계단식 복굴절 결정에 기반한 컴팩트하고 수동적인 펄스 분할 방식을 소개합니다. 방법론의 핵심은 다음과 같습니다:

1. 펄스 분할 메커니즘: 시스템은 특정 두께(10 mm 및 20 mm)를 가진 두 개의 이트륨 바나데이트($YVO_4$) 복굴절 결정($BC1$및$BC2$), 반파장판(HWP), 그리고 선형 편광기를 활용합니다. 결정의 광축(OA)과 HWP를 회전시킴으로써, 단일 입력 레이저 펄스를 조절 가능한 1개, 2개 또는 4개의 공선형(collinear) 서브 펄스 시퀀스로 변환합니다.

   • 구성 1 (분할 없음): OA 각도가 $0^\circ$일 때 단일 펄스가 생성됩니다.
   • 구성 2 ($2\times$ 분할): 두 번째 결정과 HWP를 $45^\circ$로 회전시키면 펄스 주파수가 두 배가 됩니다.
   • 구성 3 ($2\times2\times$ 분할): 첫 번째 결정을 $45^\circ$, 두 번째 결정을 $0^\circ$, HWP를 $22.5^\circ$로 설정하면 펄스 주파수가 4배가 됩니다.
   • 서브 펄스들은 피코초 지연(각각의 결정 두께에 대해 7.6 ps 및 15.2 ps)을 가지며, 교대하는 선형 편광을 가집니다.

2. 광학 설정: 펄스 분할기는 2P 라이트 시트 현미경에 통합됩니다. 시스템은 파장 가변 레이저 소스(1030 nm의 Satsuma 또는 1070 nm의 Opera)를 사용합니다. 빔은 펄스 분할 유닛, 전기 광학 변조기(EOM), 갈바노미터 미러를 통과하여 스캐닝됩니다. 조명은 10X 워터 디핑 대물렌즈를 통해 전달되며, 검출은 25X 대물렌즈와 qCMOS 카메라를 사용하여 직교 방향으로 수행됩니다.

3. 파라미터 최적화: 저자들은 살아있는 제브라피쉬 배아에서 적색 형광체(mCherry 및 jRGECO1b)를 위한 이미징 파라미터를 최적화했습니다. 물의 흡수 스펙트럼과 mCherry 2P 흡수를 고려하여, 선형 가열을 최소화하면서 여기를 극대화하기 위해 1070 nm가 선택되었습니다. 비선형 광손상에 대한 스케일링 법칙을 사용하여, 신호, 가열 및 광손상 사이의 트레이드오프를 최적화하기 위한 목표 평균 펄스 주파수는 16 MHz로 예측되었습니다. 4 MHz 소스 레이저는 $2\times2\times$ 분할 구성을 사용하여 16 MHz로 업컨버전되었습니다.

주요 결과
본 연구는 광범위한 특성 분석과 생체 내(in vivo) 이미징을 통해 펄스 분할 접근 방식의 유효성을 검증합니다:

• 이미지 품질 및 해상도: 펄스 분할 방식은 공간 해상도를 저하시키지 않았습니다. 점 퍼짐 함수(PS로 알려진 PSF) 측정 결과, 모든 구성(분할 없음, $2\times$, $2\times2\times$)에서 약 3.5 $\mu$m의 일관된 축 방향 FWHM을 보였습니다.
• 광퇴색 및 신호: 이광자 여기 형광(2PEF) 신호 강도는 전통적인 고주파 레이저와 분할 펄스 구성 간에 유사했습니다(예: 8 MHz 대 $2\times2\times2$ MHz). 결정적으로, 피코초 펄스 지연에 의해 광퇴색(photobleaching) 속도가 유의미하게 증가하지 않았으며, 이는 짧은 펄스 간격이 형광 수명을 포화시키거나 퇴색을 가속화하지 않음을 확인해 줍니다.
• 열 및 비선형 광손상:
  • 가열: 여기 파장을 1030 nm에서 1070 nm로 변경했을 때 심박수(HBR) 변화(가열의 대리 지표)가 0.68배 감소하였으며, 이는 물의 흡수 감소와 상관관계가 있습니다.
  • 비선형 손상: 비선형 광손상 임계값($P_{NL}$)은 펄스가 균등하게 분포되어 있는지 또는 피코초 지연을 두고 버스트 형태로 전달되는지와 관계없이 독립적임을 발견했습니다. 임계값은 펄스 주파수에 따라 예상되는 스케일링 법칙을 따랐으나, $2\times2\times$ 구성에서 약 40% 높은 약간의 상향 이동이 관찰되었는데, 이는 편광 성분의 미세한 공간적 변위 때문일 수 있습니다.
• 고속 이미징 성능:
  • 심장 이미aging: 1070 nm 조명과 16 MHz 유효 펄스 주파수(110 mW 평균 출력, 0.1 TW$\cdot$cm$^{-2}$ 피크 강도)를 사용하여, 저자들은 제브라피쉬 심장의 볼륨 이미징을 1052 Hz(양방향 스캐닝) 및 465 Hz(순방향 스캐닝)로 달성했습니다. 이는 150 MHz 이상(최대 163 MHz)의 픽셀 레이트에 해당하며, 이는 레이저 소스 주파수인 4 MHz보다 한 자릿수 높은 수치입니다.
  • 신경과학: 시스템은 465 Hz 프레임 레이트(165 MHz 픽셀 레이트)에서 적색 지표인 jRGECO1b를 사용하여 자발적인 신경 칼슘 역동성을 성공적으로 포착했습니다.
  • 신호 수준: 고속 동작에도 불구하고, 시스템은 픽셀당 10 포톤 이상의 신호(약 9–10 전자/픽셀)와 ~10의 신호 대 배경 비율을 유지했습니다. 광퇴색은 제한적이었으며, 수천 프레임을 획득한 후에도 신호 감소는 18–34%에 불과했습니다.

의의 및 주장
본 논문은 제안된 복굴절 기반 펄스 분할 방식이 다광자 현미경에서 시간적 조명 프로파일을 조절할 수 있는 컴팩트하고 저비용이며 견고한 방법을 제공한다고 주장합니다. 이 연구의 주요 의의는 이미지 품질을 저하시키거나 광손상을 크게 증가시키지 않으면서 킬로헤르츠 프레임 레이트의 이광자 라이트 시트 이미징과 메가헤르츠 규모의 픽셀 레이트를 가능하게 한다는 점에 있습니다.

저자들이 강조한 주요 장점은 다음과 같습니다:

1. 파라미터의 디커플링: 고정된 반복률을 가진 레이저 소스를 사용하여 파장(가열 및 흡수용)과 유효 펄스 주파수(신호 및 비선형 손상용)를 독립적으로 최적화할 수 있게 합니다.
2. 효율성: 시스템은 거의 손실이 없으며(편광 제어를 위해 편광기가 엄격히 필요한 경우 제외), 출력 빔이 본질적으로 공선형을 유지하므로 복잡한 빔 재결합이나 정렬이 필요하지 않습니다.
3. 성능: 점 스캐닝 현미경에서는 픽셀당 적어도 하나의 펄스가 필요하지만, 이 시스템은 (최대 165 MHz에 달하는) 픽속 레이트를 레이저 펄스 주파수(4 MHz)보다 훨씬 높게 달성할 수 있습니다.
4. 생물학적 생존 가능성: 이 방법은 샘플 가열을 1°C 미만으로 유지하고 낮은 광퇴색을 유지하면서, 살아있는 제브라피쉬 배아에서 빠른 생물학적 과정(심장 박동, 칼슘 역동성)을 세포 하위 수준의 해상도로 포착할 수 있게 합니다.

저자들은 이 전략이 신호 대 광손상 비율을 효과적으로 최적화하여, 빠른 생체 내 이광자 이미징을 발전시키기 위한 실행 가능한 솔루션이 된다고 결론짓습니다.