Two-photon light-sheet live imaging at kilohertz frame rate using birefringence-based pulse splitting

Technische Zusammenfassung: Zwei-Photonen-Lichtblatt-Live-Imaging mit Kilohertz-Bildrate mittels birefringenter Pulsaufspaltung

Problemstellung
Die Multiphotonen-Mikroskopie ist ein Standard für die Bildgebung von lebendem, intaktem Gewebe, doch die Bildgeschwindigkeit ist fundamental durch die Emissionsraten der Fluorophore und die Photodamage-Schwellenwerte begrenzt. Während Multipunkt-Akquisitionsschemata und Zwei-Photonen (2P) Lichtblatt-Mikroskopie eine parallele Anregung zur Steigerung der Geschwindigkeit bieten, erfordert die Optimierung des Signal-zu-Photodamage-Verhältnisses eine präzise, unabhängige Kontrolle über zwei kritische Beleuchtungsparameter: die Anregungswellenlänge und die Laserpulsfrequenz. Konventionelle Femtosekunden-Laserquellen verfügen typischerweise nicht über die notwendige Abstimmbarkeit, um beide Parameter gleichzeitig zu modulieren. Insbesondere wenn die effektive Pixelrate über einige Megahertz (MHz) hinaus gesteigert werden soll, ist oft eine Reduzierung der Pulsrepetitionsrate erforderlich, um die Spitzenintensität zu erhöhen, was jedoch die nichtlineare Photodamage und Erwärmung verstärken kann. Es besteht ein anerkannter Bedarf an kostengünstigen, effizienten und robusten Strategien zur Modulation des temporalen Anregungsprofils, um die Vorteile der 2P-Lichtblatt-Mikroskopie für die Hochgeschwindigkeits-In-vivo-Bildgebung voll auszuschöpfen.

Methodik
Die Autoren führen ein kompaktes, passives Pulsaufspaltungsschema basierend auf kaskadierten birefringenten Kristallen ein, um diese Einschränkungen zu adressen. Der Kern der Methodik umfasst:

1. Pulsaufspaltungsmechanismus: Das System nutzt zwei Yttrium-Orthovanadat ($YVO_4$) birefringente Kristalle ($BC1$ und $BC2$) mit spezifischen Dicken (10 mm und 20 mm), eine Halbwellenplatte (HWP) und einen Linearpolarisator. Durch Rotation der optischen Achsen (OA) der Kristalle und der HWP wird ein einzelner Eingabelaserpuls in eine anpassbare Sequenz von 1, 2 oder 4 kolliniären Teilpulsen umgewandelt.

   • Konfiguration 1 (Keine Aufspaltung): OA-Winkel bei $0^\circ$ resultieren in einem einzelnen Puls.
   • Konfiguration 2 (2$\times$ Aufspaltung): Rotation des zweiten Kristalls und der HWP auf $45^\circ$ verdoppelt die Pulsfrequenz.
   • Konfiguration 3 (2$\times$2$\times$ Aufspaltung): Einstellung des ersten Kristalls auf $45^\circ$, des zweiten auf $0^\circ$ und der HWP auf $22,5^\circ$ vervierfacht die Pulsfrequenz.
     Die Teilpulse sind durch Pikosekunden-Verzögerungen (7,6 ps und 15,2 ps für die jeweiligen Kristalldicken) getrennt und besitzen alternierende lineare Polarisationen.

2. Optischer Aufbau: Der Puls-Splitter ist in ein 2P-Lichtblatt-Mikroskop integriert. Das System verwendet eine wellenlängenabstimmbare Laserquelle (Satsuma bei 1030 nm oder Opera bei 1070 nm). Der Strahl passiert die Pulsaufspaltungseinheit, einen elektrooptischen Modulator (EOM) und galvanometrische Spiegel zum Scannen. Die Beleuchtung erfolgt über ein 10X Wasser-Immersionsobjektiv, während die Detektion orthogonal über ein 25X Objektiv und eine qCMOS-Kamera durchgeführt wird.

3. Parameteroptimierung: Die Autoren optimierten die Bildgebungsparameter für rote Fluorophore (mCherry und jRGECO1b) in lebenden Zebrafisch-Embryonen. Basierend auf den Wasserabsorptionsspektren und der 2P-Absorption von mCherry wurde 1070 nm gewählt, um die lineare Erwärmung zu minimieren und gleichzeitig die Anregung zu maximieren. Unter Verwendung von Skalierungsgesetzen für nichtlineare Photodamage wurde eine Ziel-Durchschnittspulsfrequenz von 16 MHz vorhergesagt, um den Kompromiss zwischen Signal, Erwärmung und Photodamage zu optimieren. Die 4 MHz Laserquelle wurde mittels der 2$\times$2$\times$ Aufspaltungskonfiguration auf 16 MHz hochgeregelt.

Wichtigste Ergebnisse
Die Studie validiert den Pulsaufspaltungsansatz durch umfassende Charakterisierung und In-vivo-Bildgebung:

• Bildqualität und Auflösung: Das Pulsaufspaltungsschema verschlechterte die räumliche Auflösung nicht. Messungen der Punktspreizfunktion (PSF) zeigten eine konsistente axiale FWHM von etwa 3,5 $\mu$m über alle Konfigurationen hinweg (keine Aufspaltung, 2$\times$ und 2$\times$2$\times$).
• Signal und Photobleaching: Die Intensität des Zwei-Photonen-angeregten Fluoreszenzsignals (2PEF) war zwischen konventionellen Hochfrequenzlasern und den Split-Puls-Konfigurationen vergleichbar (z. B. 8 MHz vs. 2$\times$2$\times$2 MHz). Entscheidend war, dass die Photobleaching-Raten durch die Pikosekunden-Verzögerungen der Pulse nicht signifikant erhöht wurden, was bestätigt, dass die kurzen Intervalle zwischen den Pulsen die Fluoreszenzlebensdauer nicht sättigen oder das Bleichen beschleunigen.
• Thermische und nichtlineare Photodamage:
  • Erwärmung: Die Verschiebung der Anregungswellenlänge von 1030 nm zu 1070 nm reduzierte die Variation der Herzschlagrate (HBR) – ein Proxy für die Erwärmung – um den Faktor 0,68, was mit der reduzierten Wasserabsorption korreliert.
  • Nichtlineare Schädigung: Die Schwelle der nichtlinearen Photodamage ($P_{NL}$) war unabhängig davon, ob die Pulse gleichmäßig verteilt oder in Bursts mit Pikosekunden-Verzögerungen abgegeben wurden. Die Schwelle folgte den erwarteten Skalierungsgesetzen mit der Pulsfrequenz, wobei eine leichte Verschiebung (ca. 40 % höher) für die 2$\times$2$\times$ Konfiguration beobachtet wurde, was potenziell auf eine geringfügige räumliche Verschiebung der Polarisationskomponenten zurückzuführen ist.
• Hochgeschwindigkeits-Bildgebungsleistung:
  • Herz-Bildgebung: Unter Verwendung von 1070 nm Beleuchtung und einer effektiven Pulsfrequenz von 16 MHz (110 mW mittlere Leistung, 0,1 TW$\cdot$cm$^{-2}$ Spitzenintensität) erreichten die Autoren eine volumetrische Bildgebung des schlagenden Zebrafischherzens mit 1052 Hz (bidirektionales Scannen) und 465 Hz (Vorwärts-Scannen). Dies entspricht Pixelraten von über 150 MHz (bis zu 163 MHz), was eine Größenordnung höher ist als die Laserquellenfrequenz (4 MHz).
  • Neurowissenschaft: Das System erfasste erfolgreich spontane neuronale Calciumdynamiken unter Verwendung des roten Indikators jRGECO1b bei einer Bildrate von 465 Hz (165 MHz Pixelrate).
  • Signalpegel: Trotz der hohen Geschwindigkeit hielt das System Signalpegel über 10 Photonen$\cdot$Pixel$^{-1}$ (ca. 9–10 Elektronen$\cdot$Pixel$^{-1}$) mit einem Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis von ~10 auf. Das Photobleichen blieb begrenzt, mit Signalabnahmen von nur 18–34 % nach der Akquisition von tausenden Frames.

Bedeutung und Ansprüche
Das Paper behauptet, dass das vorgeschlagene birefringence-basierte Pulsaufspaltungsschema eine kompakte, kostengünstige und robuste Methode zur Modulation des temporalen Beleuchtungsprofils in der Multiphotonen-Mikroskopie darstellt. Die primäre Bedeutung liegt in der Ermöglichung von Kilohertz-Bildraten der 2P-Lichtblatt-Mikroskopie mit Megahertz-Skala Pixelraten, ohne die Bildqualität zu beeinträchtigen oder die Photodamage signifikant zu erhöhen.

Die von den Autoren hervorgehobenen Hauptvorteile sind:

1. Entkopplung der Parameter: Es ermöglicht die unabhängige Optimierung von Wellenlänge (für Erwärmung und Absorption) und effektiver Pulsfrequenz (für Signal und nichtlineare Schädigung) unter Verwendung einer Laserquelle mit fester Repetitionsrate.
2. Effizienz: Das System ist nahezu verlustfrei (sofern kein Polarisator zur Polarisationskontrolle zwingend erforderlich ist) und erfordert keine komplexe Strahlrekombination oder Ausrichtung, da die Ausgangsstrahlen inhärent kolliniär bleiben.
3. Leistung: Es erreicht Pixelraten (bis zu 165 MHz), die die Laserpulsfrequenz (4 MHz) weit übersteigen – eine Fähigkeit, die in der Punktscan-Mikroskopie nicht möglich ist, wo mindestens ein Puls pro Pixel benötigt wird.
4. Biologische Lebensfähigkeit: Die Methode ermöglicht die Hochgeschwindigkeits-In-vivo-Bildgebung schneller biologischer Prozesse (Herzschlag, Calciumdynamik) in lebenden Zebrafisch-Embryonen mit subzellulärer Auflösung, während sie die Probenerwärmung unter 1°C hält und ein geringes Photobleaching beibehält.

Die Autoren kommen zu dem Schluss, dass diese Strategie das Signal-zu-Photodamage-Verhältnis effektiv optimiert und somit eine lebensfähige Lösung zur Weiterentwicklung der schnellen In-vivo Zwei-Photonen-Bildgebung darstellt.