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Two-photon light-sheet live imaging at kilohertz frame rate using birefringence-based pulse splitting

本文介绍了一种紧凑的、基于双折射的脉冲分裂方案，该方案通过实现对时间激发剖面的精确控制来优化双光子光片显微术，从而在活体斑马鱼胚胎中实现了千赫兹级的帧率和高像素率，并最大限度地减少了光损伤。

原作者： Lei Zhu, Dale Gottlieb, Vincent Maioli, Antoine Hubert, Frédéric Druon, Pierre Mahou, Emmanuel Beaurepaire, Willy Supatto

发布于 2026-06-30

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CC BY 4.0

原作者： Lei Zhu, Dale Gottlieb, Vincent Maioli, Antoine Hubert, Frédéric Druon, Pierre Mahou, Emmanuel Beaurepaire, Willy Supatto

原始论文采用 CC BY 4.0 许可（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。 ✨ 这是对下方论文的AI生成解释。它不是由作者撰写或认可的。如需技术准确性，请参阅原始论文。阅读完整免责声明

想象一下，你正试图拍摄蜂鸟振动翅膀或鱼类跳动心脏的高速视频。为了看清细节，你需要每秒拍摄数千张照片。但问题在于：用于拍摄这些照片的光线就像一个炽热的聚光灯。如果你照射得太亮或时间太长，就会“煮熟”研究对象（光损伤）或使颜色褪色（光漂白），从而毁掉图像并伤害活体组织。

这篇论文介绍了一种巧妙的光学技巧来解决这个问题，让科学家能够在不伤害生物体的情况下，以极高的速度拍摄活体斑马鱼胚胎。

核心问题：“慢”激光

显微镜中使用的标准激光器发射脉冲光的速度非常快——就像机枪射击子弹一样。然而，即使是这些“快”激光，对于观察快速生物过程所需的最快成像速度来说仍然不够快。如果你试图提高摄像机的速度以匹配动作，要么会得到黑暗、颗粒感重的图像，要么必须加大激光功率，从而损坏样本。

解决方案：“脉冲分束器”

研究人员创造了一个紧凑、低成本的设备，称之为脉冲分束器。把它想象成一个神奇的棱镜，它不仅能折射光线，还能在“时间”上克隆光线。

以下是类比：

普通激光： 想象一名鼓手每毫秒敲一下鼓。咚……咚……咚。
脉冲分束器： 研究人员在激光束的路径中放置了特殊的晶体（由钒酸钇制成）。这些晶体就像一个时间延迟镜。当单个激光脉冲撞击它们时，它会分裂成一簇紧密的、几乎在瞬间接连到达的小脉冲。
结果： 对于每一个原始脉冲，你得到的不再是一个*“咚”，而是一个快速连发的“嘚嘚嘚”*（一组由2个或4个脉冲组成的爆发）。

这实际上在不需要更换更昂贵或更强大的激光器的情况下，将照射到样本的光线“帧率”提高了一倍或两倍。这就像是用一份价格买到了四份免费的快照，而且全部压缩在极短的一瞬间内。

为什么这种方法更好

你可能会问：“如果我用更多的脉冲去撞击样本，难道不会造成更大的伤害吗？”

论文表明，由于采用了两种关键优化，事实并非如此：

正确的颜色（波长）： 他们将激光颜色从 1030 nm 切换到了 1070 nm。为什么要这样做？因为水在 1070 nm 处的吸收热量较少。这就像是从一个能高效加热水的微波炉，切换到了一个能让水保持更凉爽的微波炉。这减少了对鱼类的“烹饪”效应。
正确的时机： 通过分裂脉冲，他们可以保持较低的峰值光强，同时获得足够的总信号。论文证明，这种“爆发”模式造成的损伤并不比脉冲均匀分布时更多。事实上，损伤阈值保持不变，但图像质量得到了提升。

结果：以超慢动作拍摄生命

利用这套装置，团队拍摄了活体斑马鱼胚胎。他们实现了以下成就：

速度： 他们达到了超过 1,000 帧/秒（千赫兹量级）的成像速度。这就像是在用慢动作观察一颗子弹。
细节： 他们能够实时观察鱼类跳动的心脏，捕捉房室瓣（atrio-ventricular canal）的运动。
大脑活动： 他们还利用红色荧光标记拍摄了鱼类大脑中的钙信号。这使他们能够实时观察神经元的放电。
安全性： 尽管成像速度极快，鱼类依然保持健康。产生的热量小于 1°C，且光线没有导致荧光颜色显著褪色。

简单来说

研究人员为他们的显微镜制造了一个“时间克隆”透镜。通过将每个激光脉冲分裂成微小的多脉冲爆发，他们可以比以前更快地拍照。通过还将激光调整到一种不会像之前那样加热水的特定颜色，他们能够以惊人的细节拍摄鱼类心脏的快速跳动和大脑细胞的放电，而不会伤害这个微小的生物。

这是一种简单、廉价且有效的方法，使显微镜变得更快、更温和，为观察那些此前因速度过快或过于脆弱而无法捕捉的快速生物过程打开了大门。

技术摘要：利用基于双折射脉冲分裂技术的千赫兹帧率双光子层片活体成像

问题陈述
多光子显微术是成像活体完整组织的标准技术，但其成像速度受到荧光分子发射速率和光损伤阈值的根本限制。虽然多点采集方案和双光子（2P）层片显微术通过并行化激发来提高速度，但优化信号与光损伤比需要对两个关键照明参数进行精确且独立的控制：激发波长和激光脉冲频率。传统的飞秒激光源通常缺乏同时调制这两个参数的调节能力。具体而言，当有效像素速率超过几兆赫兹（MHz）时，通常必须降低脉冲重复频率以增加峰值强度，这可能会加剧非线性光损伤和加热。目前亟需一种低成本、高效且稳健的策略来调制时间激发剖面，以充分利用双光子层片显微术在高速活体成像中的优势。

方法论
作者引入了一种基于级联双折射晶体的紧凑型被动脉冲分裂方案，以解决这些局限性。该方法的核心在于：

脉冲分裂机制： 系统利用两个具有特定厚度（分别为 10 mm 和 20 mm）的钇钒酸橙石（ $YVO_4$ ）双折射晶体（$BC1 $和$ BC2$）、一个半波片（HWP）和一个线偏振片。通过旋转晶体的光轴（OA）和半波片，可以将单个输入激光脉冲转换为可调节的 1、2 或 4 个共线子脉冲序列。
- 配置 1（无分裂）： 光轴角度为 $0^\circ$ 时，产生单个脉冲。
- 配置 2（2 $\times$ 分裂）： 将第二个晶体和半波片旋转至 $45^\circ$ ，脉冲频率翻倍。
- 配置 3（2 $\times$ 2 $\times$ 分裂）： 将第一个晶体设为 $45^\circ$ ，第二个设为 $0^\circ$ ，半波片设为 $22.5^\circ$ ，脉冲频率变为四倍。
- 子脉冲之间的间隔为皮秒级延迟（对于各自的晶体厚度，分别为 7.6 ps 和 15.2 ps），并具有交替的线偏振特性。
光学设置： 该脉冲分裂器集成到双光子层片显微镜中。系统采用波长可调的激光源（用于 1030 nm 的 Satsuma 或用于 1070 nm 的 Opera）。光束穿过脉冲分裂单元、电光调制器（EOM）和振镜，随后进行扫描。照明通过一个 10X 水浸物镜进行，检测则通过正交方向的 25X 物镜和 qCMOS 相机完成。
参数优化： 作者针对斑马鱼胚胎中的红色荧光分子（mCherry 和 jRGECO1b）优化了成像参数。基于水的吸收光谱和 mCherry 的双光子吸收特性，选择了 1070 nm 以最小化线性加热并最大化激发。利用非线性光损伤的定标律，预测目标平均脉冲频率为 16 MHz，以优化信号、加热和光损伤之间的权衡。4 MHz 的源激光通过 2 $\times$ 2 $\times$ 分裂配置被上转换至 16 MHz。

关键结果
本研究通过广泛的表征和体内成像验证了脉冲分裂方案：

图像质量与分辨率： 脉冲分裂方案未降低空间分辨率。点扩散函数（PSF）测量显示，在所有配置（无分裂、2 $\times$ 、2 $\times$ 2 $\times$ ）下，轴向全宽半高全宽（FWHM）均保持在约 3.5 $\mu$ m。
信号与光漂白： 双光子激发荧光（2PEF）信号强度在常规高频激光器与分裂脉冲配置之间是相当的（例如，8 MHz 对比 2 $\times$ 2 $\times$ 2 MHz）。至关重要的是，皮秒级的脉冲延迟并未显著增加光漂白率，证实了极短的脉冲间隔不会饱和荧光寿命或加速光漂白。
热效应与非线性光损伤：
- 加热： 将激发波长从 1030 nm 移至 1070 nm 使心跳率（HBR）的变化（加热的代理指标）降低了 0.68 倍，这与水吸收的降低相关。
- 非线性损伤： 研究发现，非线性光损伤阈值（ $P_{NL}$ ）与脉冲是均匀分布还是以皮秒延迟的形式以脉冲串形式交付无关。该阈值遵循预期的定标律，尽管在 2 $\times$ 2 $\times$ 配置中观察到轻微的上移（约 40% 更高），这可能是由于偏振分量的微小空间位移造成的。
高速成像性能：
- 心脏成像： 使用 1070 nm 照明和 16 MHz 有效脉冲频率（110 mW 平均功率，0.1 TW $\cdot$ cm $^{-2}$ 峰值强度），作者实现了跳动斑马鱼心脏的体积成像，帧率为 1052 Hz（双向扫描）和 465 Hz（前向扫描）。这对应于超过 150 MHz（最高达 163 MHz）的像素速率，比激光源频率（4 MHz）高出一个数量级。
- 神经科学： 系统成功捕捉了使用红色指示剂 jRGECO1b 的自发神经元钙动力学，帧率为 465 Hz（165 MHz 像素速率）。
- 信号水平： 尽管速度极快，系统仍保持了高于 10 光子 $\cdot$ 像素 $^{-1}$ （约 9–10 电子 $\cdot$ 像素 $^{-1}$ ）的信号水平，信噪比约为 10。光漂白保持在较低水平，在采集数千帧后，信号仅下降了 18–34%。

意义与主张
论文声称，所提出的基于双折射的脉冲分裂方案提供了一种紧凑、低成本且稳健的方法，用于调制多光子显微术中的时间照明剖面。其主要意义在于实现了千赫兹帧率的双光子层片成像，并达到了兆赫兹级的像素速率，且不会损害图像质量或显著增加光损伤。

作者强调的主要优势包括：

参数解耦： 它允许使用固定重复频率的激光源，独立优化波长（针对加热和吸收）和有效脉冲频率（针对信号和非线性损伤）。
高效性： 该系统几乎是无损的（除非为了偏振控制而严格需要偏振片），并且不需要复杂的束流重组或对准，因为输出光束本质上是共线的。
性能： 它实现的像素速率（高达 165 MHz）远超激光脉冲频率（4 MHz），这是点扫描显微术无法实现的，因为点扫描至少需要每个像素一个脉冲。
生物可行性： 该方法有助于在保持低于 1 $^\circ$ C 的样本加热量和维持低光漂白的前提下，实现对活体斑马鱼胚胎中快速生物过程（心脏跳动、钙动力学）的亚细胞分辨率高速体内成像。

作者得出结论，该策略有效地优化了信号与光损伤之比，使其成为推进快速体内双光子成像的有效解决方案。

核心问题：“慢”激光

解决方案：“脉冲分束器”

为什么这种方法更好

结果：以超慢动作拍摄生命

简单来说

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