Two-photon light-sheet live imaging at kilohertz frame rate using birefringence-based pulse splitting

Resumen Técnico: Imagen de hoja de luz de dos fotones en tiempo real a una tasa de fotogramas de kilohertz mediante la división de pulsos basada en birrefringencia

Planteamiento del Problema
La microscopía multifotónica es un estándar para la imagen de tejidos vivos e intactos, pero su velocidad de imagen está fundamentalmente limitada por las tasas de emisión de los fluoróforos y los umbrales de fotodaño. Aunque los esquemas de adquisición multipunto y la microscopía de hoja de luz de dos fotones (2P) ofrecen una excitación paralelizada para aumentar la velocidad, la optimización de la relación señal-fotodaño requiere un control preciso e independiente sobre dos parámetros críticos de iluminación: la longitud de onda de excitación y la frecuencia del pulso láser. Las fuentes de láser de femtosegundo convencionales suelen carecer de la capacidad de sintonización para modular ambos parámetros simultáneamente. Específicamente, aumentar la tasa de píxeles efectiva más allá de unos pocos megahercios (MHz) a menudo requiere reducir la tasa de repetición de los pulsos para aumentar la intensidad de pico, lo que puede exacerbar el fotodaño no lineal y el calentamiento. Existe una necesidad reconocida de estrategias de bajo costo, eficientes y robustas para modular el perfil de excitación temporal para explotar plenamente las ventajas de la microscopía de hoja de luz de 2P para la imagen in vivo de alta velocidad.

Metodología
Los autores presentan un esquema compacto y pasivo de división de pulsos basado en cristales de birrefringencia en cascada para abordar estas limitaciones. El núcleo de la metodología consiste en:

1. Mecanismo de División de Pulsos: El sistema utiliza dos cristales birrefringentes de ortovanadato de itrio ($YVO_4$) ($BC1$y$BC2$) con espesores específicos (10 mm y 20 mm), una placa de media onda (HWP) y un polarizador lineal. Al rotar los ejes ópticos (OA) de los cristales y la HWP, un único pulso láser se convierte en una secuencia ajustable de 1, 2 o 4 sub-pulsos colineales.

   • Configuración 1 (Sin división): Los ángulos de OA en $0^\circ$ resultan en un solo pulso.
   • Configuración 2 (División 2$\times$): Rotar el segundo cristal y la HWP a $45^\circ$ duplica la frecuencia de pulso.
   • Configuración 3 (División 2$\times$2$\times$): Configurar el primer cristal a $45^\circ$, el segundo a $0^\circ$ y la HWP a $22.5^\circ$ cuadruplica la frecuencia de pulso.
   • Los sub-pulsos están separados por retrasos de picosegundos (7.6 ps y 15.2 ps para los respectivos espesores de cristal) y poseen polarizaciones lineales alternas.

2. Configuración Óptica: El divisor de pulsos se integra en un microscopio de hoja de luz de 2P. El sistema emplea una fuente láser sintonizable en longitud de onda (Satsuma a 1030 nm o Opera a 1070 nm). El haz pasa a través de la unidad de división de pulsos, un modulador electroóptico (EOM) y espejos galvonométricos para el escaneo. La iluminación se entrega mediante un objetivo de inmersión en agua de 10X, mientras que la detección se realiza ortogonalmente utilizando un objetivo de 25X y una cámara qCMOS.

3. Optimización de Parámetros: Los autores optimizaron los parámetros de imagen para fluoróforos rojos (mCherry y jRGECO1b) en embriones de pez cebra vivos. Basándose en los espectros de absorción del agua y la absorción de 2P de mCherry, se seleccionó 1070 nm para minimizar el calentamiento lineal y maximizar la excitación. Utilizando leyes de escala para el fotodaño no lineal, se predijo una frecuencia de pulso promedio objetivo de 16 MHz para optimizar el compromiso entre señal, calentamiento y fotodaño. El láser fuente de 4 MHz se up-convertía a 16 MHz utilizando la configuración de división 2$\times$2$\times$.

Resultos Clave
El estudio valida el enfoque de división de pulsos mediante una caracterización extensiva e imagen in vivo:

• Calidad de Imagen y Resolución: El esquema de división de pulsos no degradó la resolución espacial. Las mediciones de la Función de Difusión de Punto (PSF) mostraron un ancho completo a la mitad de la altura (FWHM) axial consistente de aproximadamente 3.5 $\mu$m en todas las configuraciones (sin división, 2$\times$, y 2$\times$2$\times$).
• Señal y Fotoblanqueo: La intensidad de la fluorescencia excitada por dos fotones (2PEF) fue comparable entre los láseres de alta frecuencia convencionales y las configuraciones de pulsos divididos (por ejemplo, 8 MHz vs. 2$\times$2$\times$2 MHz). Crucialmente, las tasas de fotoblanqueo no aumentaron significativamente debido a los retrasos de pulsos de picosegundos, confirmando que los intervalos cortos entre pulsos no saturan el tiempo de vida de la fluorescencia ni aceleran el blanqueo.
• Daño Térmico y No Lineal:
  • Calentamiento: Cambiar la longitud de onda de excitación de 1030 nm a 1070 nm redujo la variación de la frecuencia cardíaca (HBR, un proxy para el calentamiento) en un factor de 0.68, correlacionándose con una menor absorción de agua.
  • Daño No Lineal: Se encontró que el umbral de fotodaño no lineal ($P_{NL}$) es independiente de si los pulsos se distribuyen uniformemente o se entregan en ráfagas con retrasos de picosegundos. El umbral siguió las leyes de escala esperadas con la frecuencia de pulso, aunque se observó un ligero desplazamiento ascendente (aproximadamente 40% mayor) para la configuración 2$\times$2$\times$, potencialmente debido a un desplazamiento espacial menor de los componentes de polarización.
• Desempeño de Imagen de Alta Velocidad:
  • Imagen del Corazón: Utilizando iluminación de 1070 nm y una frecuencia de pulso efectiva de 16 MHz (110 mW de potencia media, 0.1 TW$\cdot$cm$^{-2}$ de intensidad de pico), los autores lograron la imagen volumétrica del corazón latiente de un pez cebra a 1052 Hz (escaneo bidireccional) y 465 Hz (escaneo hacia adelante). Esto corresponde a tasas de píxeles que superan los 150 MHz (hasta 163 MHz), un orden de magnitud superior a la frecuencia del láser fuente (4 MHz).
  • Neurociencia: El sistema capturó con éxito la dinámica espontánea de calcio neuronal utilizando el indicador rojo jRGECO1b a una tasa de fotogramas de 465 Hz (tasa de píxeles de 165 MHz).
  • Niveles de Señal: A pesar de la alta velocidad, el sistema mantuvo niveles de señal por encima de 10 fotones$\cdot$píxel$^{-1}$ (aprox. 9–10 electrones$\cdot$píxel$^{-1}$) con una relación señal-fondo de ~10. El fotoblanqueo se mantuvo limitado, con disminuciones de señal de solo 18–34% tras adquirir miles de fotogramas.

Significancia y Reivindicaciones
El artículo afirma que el esquema de división de pulsos basado en la birrefringencia propuesto ofrece un método compacto, de bajo costo y robusto para modular el perfil de iluminación temporal en la microscopía multifotónica. Su principal significancia radica en permitir la imagen de hoja de luz de dos fotones con tasas de fotogramas de kilohertz con tasas de píxeles de escala de megahercios sin comprometer la calidad de la imagen ni aumentar significativamente el fotodaño.

Las principales ventajas destacadas por los autores incluyen:

1. Desacoplamiento de Parámetros: Permite la optimización independiente de la longitud de onda (para calentamiento y absorción) y la frecuencia de pulso efectiva (para señal y daño no lineal) utilizando una fuente láser de frecuencia de repetición fija.
2. Eficiencia: El sistema es casi sin pérdidas (a menos que se requiera estrictamente un polarizador para el control de la polarización) y no requiere una recombinación o alineación compleja del haz, ya que los haces de salida son inherentemente colineales.
3. Desempeño: Logra tasas de píxeles (hasta 165 MHz) que exceden con creces la frecuencia del pulso del láser (4 MHz), una capacidad que no es posible en la microscopía de escaneo de punto, donde se requiere al menos un pulso por píxel.
4. Viabilidad Biológica: El método facilita la imagen in vivo de alta velocidad de procesos biológicos rápidos (latido del corazón, dinámica de calcio) en embriones de pez cebra vivos con resolución subcelular, manteniendo el calentamiento de la muestra por debajo de 1°C y manteniendo un bajo fotoblanqueo.

Los autores concluyen que esta estrategia optimiza eficazmente la relación señal-fotodaño, convirtiéndola en una solución viable para avanzar en la imagen de dos fotones in vivo de alta velocidad.