Two-photon light-sheet live imaging at kilohertz frame rate using birefringence-based pulse splitting

技術要約：複屈折に基づくパルス分割を用いたキロヘルツ・フレームレートの二光子ライトシート・ライブイメージング

問題提起
多光子顕微鏡は、生きた完全な組織のイメージングにおける標準的な手法であるが、そのイメージング速度は、蛍光体の発光率と光損傷の閾値によって根本的に制約されている。マルチポイント取得スキームや二光子（2P）ライトシート顕微鏡は、速度を上げるために並列化された励起を提供するが、信号対光損傷比を最適化するには、2つの重要な照明パラメータ、すなわち励起波長とレーザーパルス周波数の両方を精密かつ独立して制御する必要がある。従来のフェムト秒レーザー光源は通常、これら両方のパラメータを同時に変調するチューナブル性を欠いている。具体的には、有効ピクセルレートを数メガヘルツ（MHz）以上に高める場合、ピーク強度を高めるためにパルス繰り返し率を下げる必要があり、これが非線形な光損傷や加熱を悪化させる可能性がある。2Pライトシート顕微鏡の利点を最大限に活用するために、時間的な励起プロファイルを変調する、低コストで効率的かつ堅牢な戦略が求められている。

手法
著者らは、これらの制限に対処するため、カスケード接続された複屈折結晶に基づくコンパクトで受動的なパルス分割スキームを導入している。本手法の核となるのは、特定の厚さ（10 mmおよび20 mm）を持つ2つのイットリウムバナデート（$YVO_4$）複屈折結晶（$BC1$および$BC2$）、半波長板（HWP）、および線形偏光器を利用したシステムである。結晶の光学軸（OA）とHWPを回転させることで、単一の入力レーザーパルスを、調整可能な1、2、または4つの共線的なサブパルスへと変換する。

1. パルス分割メカニズム：

   • 構成1（分割なし）： OA角が$0^\circ$の場合、単一のパルスとなる。
   • 構成2（2倍分割）： 第2の結晶とHWPを$45^\circ$に回転させると、パルス周波数が2倍になる。
   • 構成3（2×2倍分割）： 第1の結晶を$45^\circ$、第2の結晶を$0^\circ$、HWPを$22.5^\circ$に設定すると、パルス周波数が4倍になる。
     サブパルスはピコ秒の遅延（それぞれの結晶の厚さに対して7.6 psおよび15.2 ps）を持ち、交互に線形偏光を有する。

2. 光学セットアップ： パルススプリッターは2Pライトシート顕微鏡に統合されている。システムは波長可変レーザー光源（Satsuma [1030 nm] または Opera [1070 nm]）を採用している。ビームはパルス分割ユニット、電気光学変調器（EOM）、およびガルバノミラーを通過する。照明は10倍の水浸型対物レンズを介して供給され、検出は25倍の対物レンズとqCMOSカメラを用いて直交方向に行われる。

3. パラメータの最適化： 著者らは、生存ゼブラフィッシュ胚における赤色蛍光体（mCherryおよびjRGECO1b）のためにイメージングパラメータを最適化した。水の吸収スペクトルとmCherryの2P吸収に基づき、線形加熱を最小限に抑えつつ励起を最大化するために1070 nmが選択された。非線形光損傷のスケーリング則に基づき、信号、加熱、および光損傷のトレードオフを最適化するために、目標とする平均パルス周波数は16 MHzと予測された。4 MHzの光源レーザーは、2×2倍分割構成を用いて16 MHzへとアップコンバートされた。

主な結果
本研究は、広範な特性評価とin vivoイメージングを通じて、パルス分割アプローチを検証している。

• 画質と解像度： パルス分割スキームは空間分解能を低下させなかった。点広がり関数（PSF）の測定では、すべての構成（分割なし、2倍、2×2倍）において、軸方向の半値全幅（FWHM）は約3.5 $\mu$mで一定であった。
• 信号と光退色： 二光子励起蛍光（2PEF）の信号強度は、従来の高周波レーザーと分割パルス構成の間で同等であった（例：8 MHz vs. 2×2×2 MHz）。決定的なことに、ピコ秒のパルス遅延によって光退色率が有意に増加することはない。これは、短いパルス間隔が蛍光寿命を飽和させたり、退色を加速させたりしないことを裏付けている。
• 熱および非線形光損傷：
  • 加熱： 励起波長を1030 nmから1070 nmにシフトすることで、心拍数（HBR）の変動（加熱のプロキシ）が0.68倍に減少した。これは水による吸収の減少と相関している。
  • 非線形損傷： 非線形光損傷の閾値（$P_{NL}$）は、パルスが均等に分布しているか、ピコ秒の遅延を伴うバーストとして送られるかにかかわらず、独立していることが判明した。閾値は期待されるパルス周波数とのスケーリング則に従ったが、2×2倍の構成では、偏光成分のわずかな空間的変位により、約40%高いわずかな上昇が観察された。
• 高速イメージング性能：
  • 心臓イメージング： 1070 nmの照明と16 MHzの実効パルス周波数（平均パワー110 mW、ピーク強度0.1 TW$\cdot$cm$^{-2}$）を使用し、著者らは鼓動するゼブラフィッシュの心臓のボリュームイメージングを、1052 Hz（双方向スキャン）および465 Hz（順方向スキャン）で達成した。これは、150 MHzを超える（最大163 MHz）ピクセルレートに相当し、レーザー光源の周波数（4 MHz）よりも1桁高い。
  • 神経科学： 本システムは、赤色インジケーターjRGEClbを用い、465 Hzのフレームレート（165 MHzピクセルレート）で自発的なニューロンのカルシウムダイナミクスを正常に捉えた。
  • 信号レベル： 高速であっても、システムは10 photons$\cdot$pixel$^{-1}$（約9–10 electrons$\cdot$pixel$^{-1}$）以上の信号レベルを維持し、信号対背景比（SBR）は約10であった。光退色は限定的であり、数千フレームの取得後でも信号の減少は18–34%にとどまった。

意義と主張
本論文は、提案された複屈折ベースのパルス分割スキームが、多光子顕微鏡において時間的な照明プロファイルを変調するための、コンパクトで低コストかつ堅牢な手法を提供すると主張している。その主な意義は、画質や光損傷を大幅に増大させることなく、キロヘルツ・フレームレートの2Pライトシートイメージングおよびメガヘルツ規模のピクセルレートを実現したことにある。

著者らが強調する主な利点は以下の通りである：

1. パラメータのデカップリング： 固定された繰り返し周期のレーザー光源を用いながら、波長（加熱と吸収のため）と実効パルス周波数（信号と非線形損傷のため）を独立して最適化できる。
2. 効率性： システムはほぼ損失がなく（偏光制御のために偏光器が厳密に必要でない限り）、出力ビームが本質的に共線的であるため、複雑なビーム再結合やアライメントを必要としない。
3. 性能： ピクセルあたり少なくとも1つのパルスが必要な点走査顕微鏡とは異なり、最大165 MHzのピクセルレートを実現しており、これはレーザーパルス周波数（4 MHz）を大幅に上回る能力である。
4. 生物学的妥当性： この手法は、サンプル加熱を1$^\circ$C未満に抑え、低い光退色を維持しながら、生存ゼブラフィッシュ胚における高速な生物学的プロセス（心拍、カルシウムダイナミクス）のサブセルラー解像度でのin vivoイメージングを容易にする。

著者らは、この戦略が信号対光損傷比を効果的に最適化し、高速なin vivo二光子イメージングを進展させるための有効な解決策となる、と結論づけている。