High-coverage DNA sequence and modification profiling of targeted genomic elements using Nanopore-based Cas12a Targeted Ligation and Enrichment Sequencing (nCasTLES).

تخيل أنك تحاول قراءة جملة محددة في مكتبة تحتوي على مليارات الكتب، ولكن الطريقة الوحيدة للقراءة هي مسح كل صفحة في كل كتاب. هذا هو التحدي الجوهري الذي يواجه العلماء الذين يستخدمون نوعًا جديدًا وقويًا من تقنية تسلسل الحمض النووي (DNA) تسمى "تسلسل النانو بوري" (nanopore sequencing). هذه الطريقة فريدة لأنها تستطيع قراءة خيوط طويلة من الحمض النووي في عملية واحدة، والأهم من ذلك، أنها تستطيع رؤية العلامات الكيميائية الموجودة على الحمض النووي والتي تعمل مثل المفاتيح، حيث تقوم بتشغيل الجينات أو إيقافها. هذه العلامات حيوية لفهم أمراض مثل السرطان، لكن هذه التقنية تعاني من عيب كبير: فهي بطيئة وغير فعالة. فمن أجل العثور على المناطق الجينية المحددة التي تهم العالم، غالبًا ما تترك الطرق الحالية كميات هائلة من الحمض النووي "الخامل" غير المفيد الذي يسد الجهاز، مما يهدر الوقت والمال ويمنع الباحث من قراءة معلومات مهمة أخرى في نفس العينة.

لقد طور فريق من الباحثين في مدرسة ماساتشوستس تشان الطبية للطب بجامعة ماساتشوستس طريقة جديدة لحل هذه المشكلة، مما يسمح للعلماء بعزل الحمض النووي الذي يريدون دراسته بالضبط مع الحفاظ على بقية العينة نظيفة ومفيدة. وقد أطلقوا على طريقتهم اسم "nCasTLES". وبدلاً من ترك الحمض النووي غير المرغوب فيه ليبقى داخل الجهاز، تقوم هذه الطريقة الجديدة بإزالته فيزيائيًا قبل بدء عملية التسلسل. ومن خلال استخدام أداة جزيئية تعمل مثل مقص لقص الحمض النووي في نقاط دقيقة، يقوم الفريق بإنشاء نهايات لاصقة صغيرة للحمض النووي المستهدف. ثم يستخدمون نظام التقاط يشبه المغناطيس لسحب تلك القطع المحددة فقط من الخليط، وغسل الباقي. وهذا يترك عينة نقية من الحمض النووي المستهدف يمكن تسلسلها جنبًا إلى جنب مع حمض نووي آخر من نفس العينة، مما يضاعف قيمة التجربة فعليًا.

اختبر الباحثون هذه الطريقة على محرك جيني معقد يوجد في نوع معين من الخلايا السرطانية. تحتوي هذه الخلايا على حلقات إضافية من الحمض النووي، تُعرف باسم الحمض النووي خارج الكروموسومي، والتي تحمل عددًا كبيرًا من النسخ من جين خطير يسمى "MYCN". وباستخدام تقنيتهم الجديدة، تمكن الفريق من عزل حلقات الحمض النووي المحددة هذه من بقية المادة الوراثية للخلية. كانت النتائج مذهلة: فقد التقطت الطريقة الجديدة قدرًا أكبر بنحو أربعين مرة من الحمض النووي المستهدف في الساعة مقارنة بالتسلسل القياسي بدون إغناء. والأهم من ذلك، نظرًا لإزالتهم للحمض النووي غير المفيد، عمل الجهاز لفترة أطول وبصحة أفضل، مما أنتج كمية هائلة من البيانات المفيدة. في التشغيل القياسي، قد يكافح الجهاز لقراءة أي شيء آخر بمجرد العثور على الحمض النووي المستهدف، ولكن هنا، استطاع الباحثون أيضًا قراءة الجينوم الكامل للخلايا السرطانية في نفس التشغيل، مما كشف عن بنية تلك الحلقات الإضافية من الحمض النووي بدقة عالية.

ولإثبات أن الطريقة تعمل على مستوى أكثر دقة، توجه الفريق إلى جين يسمى "MGMT"، والذي غالبًا ما يتم إسكاته بواسطة علامات كيميائية لدى المرضى المصابين بورم دماغي مميت يسمى "الورم الأرومي الدبقي" (glioblastoma). وتعد القدرة على رؤية هذه العلامات دون تدمير الحمض النووي ميزة رئيسية، حيث تتطلب الطرق التقليدية مواد كيميائية قاسية تمحو هذه المعلومات. قام الباحثون بخلط الحمض النووي من خطين مختلفين لخلايا الأورام الدماغية: أحدهما يكون فيه الجين مغطى بكثافة بالعلامات ومسكتًا، والآخر لا يكون كذلك. استخدموا طريقتهم الجديدة لاستخراج الجين من كلا الخطين وتسلسلهما معًا. نجح الجهاز في التمييز بين الخطين الخلويين بناءً على اختلافات جينية دقيقة ورسم خرائط للعلامات الكيميائية على كل خيط من خيوط الحمض النووي. وكشف هذا أن الجين كان مسكتًا بشكل عام في أحد الخطوط، ولكن كانت هناك اختلافات دقيقة في كيفية ترتيب العلامات مقارنة بالآخر. حتى أن الطريقة رصدت خيوطًا نادرة تبدو في منتصف تغيير حالة علاماتها، وهو تفصيل كان سيتم تفويته باستخدام التقنيات القديمة ذات القراءات الأقصر.

تتجاوز قوة هذا النهج مجرد العثور على جينات معروفة. فقد استخدم الباحثون هذه الطريقة أيضًا لتتبع مكان انغراس فيروس في الجينوم البشري، وهي عملية تحدث عشوائيًا وغالبًا ما تُستخدم لدراسة كيفية سلوك الخلايا. أصابوا الخلايا بفيروس لينتي (lentivirus) واستخدموا طريقتهم لاستخراج المواقع الدقيقة التي استقر فيها الفيروس. ولأن الطريقة تزيل بقية الحمض النووي، فقد تمكنوا من رؤية موقع اندماج الفيروس والحمض النووي البشري المحيط به في قطعة واحدة. سمح لهم ذلك بمقارنة مجموعات مختلفة من الخلايا ورؤية ما إذا كان الفيروس قد استقر في أجزاء نشطة من الجينوم، أم في مناطق هادئة وغير نشطة. ووجدوا أن الخلايا التي استقر فيها الفيروس في مناطق نشطة نمت بشكل أسرع وكانت أكثر مقاومة لعقار العلاج الكيميائي، مما يشير إلى أن موقع الاندماج أثر بشكل مباشر على سلوك الخلية.

ولعل الجانب الأكثر إثارة للدهشة في هذا العمل هو ما حدث للحمض النووي الذي تم غسله بعيدًا. ففي الطرق السابقة، كان الحمض النووي الذي ليس هو الهدف يُهمل أو يصبح عديم الفائدة. أما في هذا النظام الجديد، نظرًا لأن الحمض النووي غير المرغوب فيه يتم إزالته بشكل نظيف بدلاً من مجرد تجاهله، فإنه يمكن حفظه وتسلسله جنبًا إلى جنب مع الهدف. أظهر الباحثون أن هذا "الحمض النووي الضائع" يمكن استخدامه لبناء خريطة كاملة لجينوم الخلية السرطانية، مما يكشف عن تغيرات واسعة النطاق، مثل فقدان كروموسوم كامل، يحدث أثناء نمو الخلايا. وهذا يعني أن تجربة واحدة يمكنها الآن الإجابة على أسئلة متعددة: يمكنها النظر في جين محدد، ورؤية علاماته الكيميائية، وتتبع مكان هبوط فيروس، ورسم خريطة لبنية الجينوم بأكملها في آن واحد.

توضح الدراسة أنه من خلال تغيير كيفية تحضير الحمض النووي للتسلسل، يمكننا الحصول على معلومات أكثر من نفس كمية المواد. لا تتطلب طريقتهم الجديدة كميات ضخمة من الحمض النووي الأولي، وهو أمر يمثل قيدًا عند العمل مع عينات المرضى الثمينة. كما أنها تتجنب الحاجة إلى تضخيم الحمض النووي، وهي خطوة يمكن أن تؤدي إلى أخطاء وتمحو العلامات الكيميائية التي يحاول العلماء دراستها. ورغم أن الطريقة لها بعض الحدود، مثل الحد الأقصى لحجم قطع الحمض النووي التي يمكنها التعامل معها، إلا أنها تمثل خطوة كبيرة للأمام في جعل تسلسل الجيل الثالث عمليًا للأسئلة البيولوجية المعقدة. ومن خلال تحويل عملية كانت ذات يوم بمثابة عنق زجاجة إلى سير عمل سلس، يفتح هذا النهج الباب لدراسة الجينوم بطرق كانت في السابق بطيئة للغاية، أو مكلفة للغاية، أو معقدة للغاية للمحاولة.