High-coverage DNA sequence and modification profiling of targeted genomic elements using Nanopore-based Cas12a Targeted Ligation and Enrichment Sequencing (nCasTLES).
本文介绍了 nCasTLES，这是一种基于纳米孔的靶向测序方法，通过利用 Cas12a 生成的悬垂进行磁珠富集以消除惰性脱靶 DNA，从而实现对基因组元件及修饰的高覆盖度分析，同时显著提高了流式细胞仪的通量，并允许对全基因组文库进行同步分析。
原始论文采用 CC BY 4.0 许可（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。 这是一篇未经同行评审的预印本的AI生成解释。这不是医疗建议。请勿根据此内容做出健康决定。 阅读完整免责声明
想象一下，试图在一座拥有数十亿本书的图书馆中阅读一个特定的句子，但唯一的阅读方式是扫描每一本书的每一页。这就是科学家在使用一种被称为纳米孔测序（nanopore sequencing）的强大新型 DNA 测序技术时面临的基本挑战。这种方法非常独特，因为它能一次性读取长链 DNA，并且至关重要的是，它能看到 DNA 上的化学标签，这些标签就像开关一样，可以开启或关闭基因。这些标签对于理解癌症等疾病至关重要，但这项技术有一个主要的缺陷：它既慢又低效。为了找到科学家感兴趣的特定遗传区域，目前的方法往往会留下大量无用的、“惰性”的 DNA，这些 DNA 会堵塞机器，在浪费时间、金钱的同时，也阻碍了研究人员阅读样本中其他重要信息。
马萨诸塞大学医学查恩分校的一个研究小组开发了一种解决此问题的新方法，使科学家能够分离出他们想要研究的精确 DNA，同时保持样本其余部分的洁净与有用。他们将这种方法称为 nCasTLES。这种新方法并非让不需要的 DNA 留在机器中，而是在测序开始前就将其物理移除。通过使用一种像剪刀一样能在精确位置切割 DNA 的分子工具，该团队为目标 DNA 创造了微小的、具有粘性的末端。然后，他们使用一种类似于磁性捕获的系统，仅将这些特定的片段从混合物中拉出，并将其余部分洗掉。这留下了一个纯净的目标 DNA 样本，可以与来自同一样本的其他 DNA 一起进行测序，从而有效地使实验价值翻倍。
研究人员在一种存在于特定类型癌细胞系中的复杂遗传驱动因子上测试了这种方法。这些细胞含有额外的 DNA 环，即染色体外 DNA，这些环携带了大量危险的癌基因——MYCN。使用这种新技术，团队能够从细胞的其他遗传物质中分离出这些特定的 DNA 环。结果令人瞩目：与不进行富集的标准测序相比，新方法每小时捕捉到的目标 DNA 量增加了近四十倍。更重要的是，由于移除了无用的 DNA，机器运行得更久且更健康，产生了大量的有用数据。在标准运行中，一旦找到目标 DNA，机器可能会难以读取任何其他内容，但在这种情况下，研究人员也可以在同一次运行中读取癌细胞的整个基因组，从而高精度地揭示那些额外 DNA 环的结构。
为了证明该方法在更细微层面的有效性，团队转向研究一个名为 MGMT 的基因，该基因在患有致命脑肿瘤（胶质母细胞瘤）的患者体内经常被化学标签沉默。能够在不破坏 DNA 的情况下观察这些标签是一项重大优势，因为传统方法需要使用会抹除这些信息的强力化学试剂。研究人员混合了来自两种不同脑肿瘤细胞系的 DNA：一种细胞系的基因被大量标记并处于沉默状态，而另一种则没有。他们使用这种新方法从两类细胞系中提取出该基因并将其共同测序。机器成功地根据微小的遗传差异区分了这两种细胞系，并绘制了每一条 DNA 单链上的化学标签图谱。这揭示了虽然该基因在一种细胞系中普遍处于沉默状态，但其标签排列方式与另一种细胞系相比存在微妙差异。该方法甚至发现了那些似乎正处于标签状态变化过程中的稀有单链，而这是一个在旧有的、读长较短的技术中会被忽略的细节。
这种方法的威力不仅限于寻找已知基因。研究人员还利用它来追踪病毒是如何插入人类基因组的——这是一个随机发生的过程，常用于研究细胞行为。他们感染了细胞一种慢病毒，然后使用该方法钓取病毒着陆的确切位置。由于该方法移除了其余的 DNA，他们可以完整地看到病毒的整合位点及其周围的人类 DNA。这使他们能够比较不同的细胞组，并发现一些细胞的病毒落在活跃的基因组区域，而另一些则落在安静、不活跃的区域。他们发现，病毒落在活跃区域的细胞生长更快，且对某种化疗药物具有更强的抗性，这表明插入的位置直接影响了细胞的行为。
这项工作最令人惊讶的方面之一是那些被洗掉的 DNA 发生了什么。在以往的方法中，不是目标的 DNA 会被丢弃或变得毫无用处。而在这个新系统中，由于不需要的 DNA 是被干净地移除而非仅仅被忽略，因此它可以被保存下来并与目标一起进行测序。研究人员展示了这种“废物” DNA 可以被用来构建完整的癌细胞基因组图谱，揭示大规模的变化，例如细胞生长过程中发生的整个染色体的丢失。这意味着单次实验现在可以回答多个问题：它可以观察特定基因、查看其化学标签、追踪病毒的着陆位置，并同时绘制整个基因组的结构。
这项研究表明，通过改变我们准备 DNA 进行测序的方式，我们可以从同样数量的材料中获得更多信息。该方法不需要大量的起始 DNA，这通常是处理珍贵患者样本时的限制因素。它还避免了使用 DNA 扩增，而扩增步骤可能会引入错误并抹除科学家试图研究的化学标签。尽管该方法存在一些限制，例如处理 DNA 片段的最大尺寸，但它代表了使第三代测序在处理复杂生物学问题时更具实用性的重要一步。通过将曾经的瓶颈转变为流线型的工作流程，这种方法为以过去认为太慢、太贵或太混乱而无法尝试的方式来研究基因组打开了大门。
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