High-coverage DNA sequence and modification profiling of targeted genomic elements using Nanopore-based Cas12a Targeted Ligation and Enrichment Sequencing (nCasTLES).

Stel je voor dat je probeert een specifieke zin te lezen in een bibliotheek met miljarden boeken, maar de enige manier om te lezen is door elke pagina van elk boek te scannen. Dit is de fundamentele uitdaging waarmee wetenschappers worden geconfronteerd die gebruikmaken van een krachtig nieuw type DNA-sequencingtechnologie genaamd nanopore-sequencing. Deze methode is uniek omdat het lange strengen DNA in één keer kan lezen en, cruciaal, het kan chemische labels op het DNA zien die fungeren als schakelaars, die genen aan- of uitzetten. Deze labels zijn essentieel voor het begrijpen van ziekten zoals kanker, maar de technologie heeft een groot gebrek: het is traag en inefficiënt. Om de specifieke genetische regio's te vinden waar een wetenschapper belang bij heeft, laten huidige methoden vaak enorme hoeveelheden nutteloos, "inert" DNA achter dat de machine verstopt, wat tijd en geld verspilt terwijl het de onderzoeker verhindert om andere belangrijke informatie in dezelfde monster te lezen.

Een team onderzoekers aan de University of Massachusetts Chan Medical School heeft een nieuwe manier ontwikkeld om dit probleem op te lossen, waardoor wetenschappers precies het DNA kunnen isoleren dat ze willen bestuderen, terwijl de rest van het monster schoon en bruikbaar blijft. Ze noemen hun methode nCasTLES. In plaats van het ongewenste DNA in de machine te laten zitten, verwijdert deze nieuwe aanpak het fysiek voordat de sequencing begint. Door een moleculair instrument te gebruiken dat werkt als een schaar om DNA op precieze plekken door te knippen, creëert het team kleine, plakkerige uiteinden op het doel-DNA. Vervolgens gebruiken ze een magnetisch-achtig capturesysteem om alleen die specifieke stukjes uit de mix te trekken, waarbij de rest wordt weggespoeld. Dit laat een zuiver monster van het doel-DNA achter dat naast ander DNA uit hetzelfde monster kan worden gesequenced, wat de waarde van het experiment effectief verdubbelt.

De onderzoekers testten deze methode op een complexe genetische driver die wordt gevonden in een specif kind van een specifiek type kankercellijn. Deze cellen bevatten extra ringen van DNA, bekend als extrachromosomaal DNA, die een hoog aantal kopieën dragen van een gevaarlijk kankergen genaamd MYCN. Met behulp van hun nieuwe techniek was het team in staat om deze specifieke DNA-ringen te isoleren van de rest van het genetische materiaal van de cel. De resultaten waren opmerkelijk: de nieuwe methode ving bijna veertig keer meer van het doel-DNA per uur op vergeleken met standaard sequencing zonder verrijking. Belangrijker nog, omdat ze het nutteloze DNA hadden verwijderd, draaide de machine langer en gezonder, wat een enorme hoeveelheid nuttige data opleverde. In een standaardrun kan de machine moeite hebben om nog iets anders te lezen zodra het doel-DNA is gevonden, maar hier konden de onderzoekers ook het volledige genoom van de kankercellen in dezelfde run lezen, wat de structuur van die extra DNA-ringen met hoge precisie onthulde.

Om te bewijzen dat de methode op een subtieler niveau werkt, richtte het team zich op een gen genaamd MGMT, dat vaak wordt uitgeschakeld door chemische labels in patiënten met een dodelijke hersentumor genaamd glioblastoom. Het vermogen om deze labels te zien zonder het DNA te vernietigen is een groot voordeel, aangezien traditionele methoden harde chemicaliën vereisen die deze informatie wissen. De onderzoekers mengden DNA van twee verschillende hersentumorcellijnen: één waar het gen zwaar getagd en uitgeschakeld was, en één waar dat niet het geval was. Ze gebruikten hun nieuwe methode om het gen uit beide lijnen eruit te vissen en deze samen te sequencen. De machine onderscheidde de twee cellijnen succesvol op basis van minuscule genetische verschillen en bracht de chemische labels op elke enkele streng DNA in kaart. Dit onthulde dat hoewel het gen over het algemeen werd uitgeschakeld in de ene lijn, er subtiele verschillen waren in hoe de labels waren gerangschikt in vergelaging met de andere lijn. De methode spoot zelfs zeldzame strengen op die zich midden in het veranderen van hun labelstatus bevonden, een detail dat door oudere, kortere-read technologieën gemist zou zijn.

De kracht van deze aanpak strekt zich uit voorbij het simpelweg vinden van bekende genen. De onderzoekers gebruikten de methode ook om te volgen waar een virus zichzelf in het menselijk genoom had ingevoegd, een proces dat willekeurig gebeurt en vaak wordt gebruikt om te bestudeden hoe cellen zich gedragen. Ze infecteerden cellen met een lentivirus en gebruikten vervolgens hun methode om de exacte plekken te vissen waar de virus was geland. Omdat de methode de rest van het DNA verwijdert, konden ze de integratieplaats van het virus en het omliggende menselijke DNA in één stuk zien. Dit stelde hen in staat om verschillende groepen cellen te vergelijken en te zien dat bij sommige cellen het virus in actieve delen van het genoom landde, terwijl het bij andere in stille, inactieve gebieden landde. Ze ontdekten dat cellen met het virus in actieve gebieden sneller groeiden en resistenter waren tegen een bepaod chemotherapie middel, wat suggereert dat de locatie van de insertie het gedrag van de cel direct beïnvloedde.

Misschien wel het meest verrassende aspect van dit werk is wat er gebeurde met het DNA dat werd weggespoeld. Bij eerdere methoden werd het DNA dat niet het doelwit was, weggegooid of onbruikbaar gemaakt. In dit nieuwe systeem, omdat het ongewenste DNA netjes wordt verwijderd in plaats van alleen maar genegeerd, kan het worden bewaard en samen met het doelwit worden gesequenced. De onderzoekers toonden aan dat dit "afval"-DNA kon worden gebruikt om een volledige kaart van het genoom van de kankercel te bouwen, wat grootschalige veranderingen onthulde, zoals het verlies van een hele chromosoom, die optraden terwijl de cellen groeiden. Dit betekent dat een enkel experiment nu meerdere vragen kan beantwoorden: het kan kijken naar een specifiek gen, de chemische labels zien, volgen waar een virus landde, en tegelijkert de gehele genoomstructuur in kaart brengen.

De studie demonstreert dat door de manier waarop we DNA voorbereiden voor sequencing te veranderen, we veel meer informatie kunnen krijgen uit hetzelfde materiaal. De nieuwe methode vereist geen enorme hoeveelheden start-DNA, wat vaak een beperking is bij het werken met kostbare patiëntmonsters. Het vermijdt ook de noodzaak om het DNA te amplificeren, een stap die fouten kan introduceren en de chemische labels die wetenschappers willen bestuderen kan wissen. Hoewel de methode enkele beperkingen heeft, zoals een maximale grootte voor de DNA-fragmenten die het kan verwerken, vertegenwoordigt het een belangrijke stap voorwaarts in het praktisch maken van third-generation sequencing voor complexe biologische vragen. Door een proces dat ooit een bottleneck was te veranderen in een gestroomlijnde workflow, opent deze aanpak de deur naar het bestuderen van het genoom op manieren die voorheen te traag, te duur of te rommelig waren om te proberen.