High-coverage DNA sequence and modification profiling of targeted genomic elements using Nanopore-based Cas12a Targeted Ligation and Enrichment Sequencing (nCasTLES).
本論文は、Cas12aによって生成されたオーバーハングを用いたビーズ濃縮により、不活性なオフターゲットDNAを除去し、それによってゲノム要素および修飾の高カバレッジなプロファイリングを可能にすると同時に、フローセルのスループットを大幅に向上させ、全ゲノムライブラリの同時解析を可能にする、ナノポアベースの標的シーケンシング手法であるnCasTLESを導入するものである。
原論文は CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) でライセンスされています。 これは査読を受けていないプレプリントのAI生成解説です。医学的助言ではありません。この内容に基づいて健康上の判断をしないでください。 免責事項の全文を読む
何十億冊もの本がある図書館の中で、特定の文章を読もうとしている場面を想像してみてください。しかし、唯一の読み方として、すべての本のすべてのページをスキャンしなければならないとしたらどうでしょう。これが、ナノポア・シーケンシングと呼ばれる強力な新しいタイプのDNAシーケンシング技術を使用する科学者たちが直面している根本的な課題です。この手法は、長いDNA鎖を一気に読み取ることができ、さらに決定的なことに、遺伝子のオン・オフを切り替えるスイッチとして機能するDNA上の化学的タグを見ることができるという点で独特です。これらのタグはがんのような疾患を理解するために不可欠ですが、この技術には大きな欠点があります。それは、遅くて非効率的であることです。科学者が関心を持つ特定の遺伝領域を見つけ出すために、現在の方法では、しばしば大量の役に立たない「不活性な」DNAが装置内に残り、それが機械を詰まらせ、時間と費用を浪費し、研究者が同じサンプル内の他の重要な情報を読むことを妨げてしまいます。
マサチューセッツ大学チャン医科大学の研究チームは、科学者が研究したいDNAを正確に単離し、残りのサンプルをクリーンで有用な状態に保つことができる新しい方法を開発しました。彼らはこの手法をnCasTLESと呼んでいます。不要なDNAを装置の中に放置しておく代わりに、この新しいアプローチでは、シーケンシングが始まる前にそれを物理的に除去します。DNAを正確な箇所で切断するハサミのように機能する分子ツールを使用することで、チームは標的DNAに小さな粘着性の端（スティッキーエンド）を作ります。次に、磁石のようなキャプチャーシステムを使用して、混合物の中からそれらの特定の断片だけを引き出し、残りを洗い流します。これにより、標的となるDNAの純粋なサンプルが残り、それを同じサンプル内の他のDNAと共にシーケンシングできるため、実験の価値を実質的に倍増させることができます。
研究者たちは、特定の癌細胞株に見られる複雑な遺伝的ドライバーを用いてこの方法をテストしました。これらの細胞は、MYCNという危険な癌遺伝子のコピーを多数持つ、染色体外DNAと呼ばれる余分なDNAの輪を含んでいます。この新しい技術を用いることで、チームはこれらの特定のDNAの輪を、細胞の他の遺伝物質から分離することに成功しました。結果は驚くべきものでした。新しい手法は、濃縮なしの標準的なシーケンシングと比較して、標的DNAを1時間あたり約40倍多く捕捉しました。より重要なことに、役に立たないDNAを除去したため、機械はより長く、より健全に稼働し、膨大な量の有用なデータを生み出しました。標準的な実行では、標的DNAが見つかった後に機械が他のものを読み取るのに苦労することがありますが、ここでは、研究者は同じ実行内で癌細胞の全ゲノムを読み取ることもでき、それらの余剰DNAの輪の構造を高精度に明らかにしました。
この手法がより微細なレベルでも機能することを証明するために、チームはMGMTと呼ばれる遺伝子に注目しました。この遺伝子は、死に至る脳腫瘍である膠芽腫（グリオブラストーマ）の患者において、化学的タグによってしばしば抑制されています。DNAを破壊せずにこれらのタグを見ることができることは大きな利点です。なぜなら、従来の方法では、この情報を消し去ってしまう過酷な化学薬品を必要とするからです。研究者たちは、遺伝子が激しくタグ付けされ抑制されている細胞株と、そうでない細胞株という、2つの異なる脳腫瘍細胞株のDNAを混合しました。彼らはこの新しい方法を用いて両方の細胞株から遺伝子を引き出し、それらを一緒にシーケンシングしました。機械は、微細な遺伝的差異に基づいてこれら2つの細胞株を識別し、個々のDNA鎖上の化学的タグをマッピングしました。これにより、一方は遺伝子が全般的に抑制されている一方で、もう一方と比較してタグの配置に微妙な違いがあることが明らかになりました。この手法は、タグの状態が変化している最中にある希少な鎖さえも特定しましたが、これは古い短鎖技術では見逃されていた詳細です。
このアプローチの力は、既知の遺伝子を見つけることだけに留まりません。研究者たちはまた、ウイルスがヒトゲノムのどこに挿入されたかを追跡するためにもこれを使用しました。これはランダムに起こるプロセスであり、細胞の挙動を研究するためによく用いられます。彼らはレンチウイルスに細胞を感染させ、その後、ウイルスが着地した正確な場所を釣り上げるためにこの方法を使用しました。この方法では残りのDNAを除去するため、ウイルスが統合された部位とその周囲のヒトDNAを一つの断片として見ることができます。これにより、異なる細胞グループを比較し、ウイルスが活動的なゲノム領域に降り立ったのか、あるいは静かな不活性領域に降り立ったのかを確認することができました。彼らは、ウイルスが活動的な領域に入った細胞の方が、より速く成長し、化学療法剤に対して耐性を持つことを発見しました。これは、挿入の場所が細胞の挙動に直接影響を与えていることを示唆しています。
この研究の最も驚くべき側面の一つは、洗い流されたDNAに何が起きたかです。以前の方法では、標的ではないDNAは破棄されるか、役に立たなくなっていました。しかし、この新しいシステムでは、不要なDNAが単に無視されるのではなく、きれいに除去されるため、それを保存して標的と共にシーケンシングすることができます。研究者たちは、この「廃棄物」となるDNAを使用して、癌細胞の完全なゲノチ・マップを作成できることを示し、細胞が増殖する過程で起こる染色体全体の消失といった大規模な変化を明らかにしました。つまり、単一の実験で複数の問いに答えることができるのです。特定の遺伝子を調べ、その化学的タグを確認し、ウイルスがどこに降り立ったかを追跡し、ゲノム全体の構造を一度にマッピングすることが可能です。
この研究は、DNAの準備方法を変えることで、同じ量の材料からより多くの情報を得られることを示しています。この新しい方法は、貴重な患者サンプルを扱う際にしばしば制限となる、大量の開始DNAを必要としません。また、研究者が調べようとしている化学的タグを消し去ってしまう可能性があるDNA増幅のステップも回避しています。この手法には、扱えるDNA断片の最大サイズなどの限界もありますが、第三世代シーケンシングを複雑な生物学的問題に対して実用的なものにするための重要な一歩となります。かつてはボトルネックであったプロセスを合理化されたワークフローに変えることで、このアプローチは、以前は遅すぎたり、高価すぎたり、あるいは複雑すぎて試すことが困難だった方法でゲノムを研究する扉を開いています。
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