High-coverage DNA sequence and modification profiling of targeted genomic elements using Nanopore-based Cas12a Targeted Ligation and Enrichment Sequencing (nCasTLES).

Imaginez essayer de lire une phrase spécifique dans une bibliothèque contenant des milliards de livres, mais avec la seule possibilité de lire en scannant chaque page de chaque livre. C'est le défi fondamental auquel sont confrontés les scientifiques qui utilisent un nouveau et puissant type de technologie de séquençage d'ADN appelé séquençage par nanopores. Cette méthode est unique car elle peut lire de longs brins d'ADN en une seule fois et, surtout, elle peut voir les marqueurs chimiques sur l'ADN qui agissent comme des interrupteurs, activant ou désactivant les gènes. Ces marqueurs sont essentiels pour comprendre des maladies comme le cancer, mais la technologie présente un défaut majeur : elle est lente et inefficace. Pour trouver les régions génétiques spécifiques qui intéressent un scientifique, les méthodes actuelles laissent souvent derrière elles de vastes quantités d'ADN inutile et « inerte » qui encombre la machine, gaspillant ainsi du temps et de l'argent tout en empêchant le chercheur de lire d'autres informations importantes dans le même échantillon.

Une équipe de chercheurs de la UMass Chan Medical School a développé une nouvelle façon de résoudre ce problème, permettant aux scientifiques d'isoler exactement l'ADN qu'ils souhaitent étudier tout en gardant le reste de l'échantillon propre et utile. Ils appellent leur méthode nCasTLES. Au lieu de laisser l'ADN indésirable stagner dans la machine, cette nouvelle approche l'élimine physiquement avant que le séquençage ne commence. En utilisant un outil moléculaire qui agit comme une paire de ciseaux pour couper l'ADN à des endroits précis, l'équipe crée de minuscules extrémités collantes sur l'ADN cible. Ils utilisent ensuite un système de capture de type magnétique pour extraire uniquement ces morceaux spécifiques du mélange, en éliminant le reste par lavage. Cela laisse un échantillon pur de l'ADN cible qui peut être séquencé aux côtés d'autres ADN provenant du même échantillon, doublant ainsi l'efficacité de l'expérience.

Les chercheurs ont testé cette méthode sur un moteur génétique complexe trouvé dans une lignée de cellules cancéreuses spécifique. Ces cellules contiennent des anneaux supplémentaires d'ADN, connus sous le nom d'ADN extrachromosomique, qui transportent un grand nombre de copies d'un gène cancéreux dangereux appelé MYCN. En utilisant leur nouvelle technique, l'équipe a pu isoler ces anneaux d'ADN spécifiques du reste du matériel génétique de la cellule. Les résultats ont été frappants : la nouvelle méthode a capturé près de quarante fois plus d'ADN cible par heure par rapport au séquençage standard sans enrichissement. Plus important encore, parce qu'ils ont supprimé l'ADN inutile, la machine a fonctionné plus longtemps et de manière plus saine, produisant une quantité massive de données utiles. Dans un cycle standard, la machine pourrait avoir du mal à lire quoi que ce soit d'autre une fois l'ADN cible trouvé, mais ici, les chercheurs ont également pu lire l'intégralité du génome des cellules cancéreuses lors du même cycle, révélant la structure de ces anneaux d'ADN supplémentaires avec une grande précision.

Pour prouver que la méthode fonctionne à un niveau plus subtil, l'équipe s'est tournée vers un gène appelé MGMT, qui est souvent silencieux à cause de marqueurs chimiques chez les patients atteints d'une tumeur cérébrale mortelle appelée glioblastome. La capacité de voir ces marqueurs sans détruire l'ADN est un avantage majeur, car les méthodes traditionnelles nécessitent des produits chimiques agressifs qui effacent cette information. Les chercheurs ont mélangé de l'ADN provenant de deux lignées cellulaires de tumeurs cérébrales différentes : une où le gène était fortement marqué et silencieux, et une autre où il ne l'était pas. Ils ont utilisé leur nouvelle méthode pour extraire le gène des deux lignées et les séquencer ensemble. La machine a réussi à distinguer les deux lignées cellulaires grâce à de minuscules différences génétiques et a cartographié les marqueurs chimiques sur chaque brin d'ADN. Cela a révélé que, bien que le gène soit généralement silencieux dans une lignée, il existait des différences subtiles dans la façon dont les marqueurs étaient disposés par rapport à l'autre. La méthode a même repéré des brins rares qui semblaient être en plein milieu d'un changement de statut de marquage, un détail qui aurait été manqué par les technologies plus anciennes à lectures courtes.

La puissance de cette approche s'étend au-delà de la simple recherche de gènes connus. Les chercheurs ont également utilisé cette méthode pour suivre l'endroit où un virus s'était inséré dans le génome humain, un processus qui se produit de manière aléatoire et qui est souvent utilisé pour étudier le comportement des cellules. Ils ont infecté des cellules avec un lentivirus et ont ensuite utilisé leur méthode pour débusquer les endroits exacts où le virus s'était posé. Parce que la méthode élimine le reste de l'ADN, ils ont pu voir le site d'intégration du virus et l'ADN humain environnant en un seul morceau. Cela leur a permis de comparer différents groupes de cellules et de voir que, pour certains, le virus s'était logé dans des parties actives du génome, tandis que pour d'autres, il s'était logé dans des zones calmes et inactives. Ils ont découvert que les cellules avec le virus dans des zones actives croissaient plus rapidement et étaient plus résistantes à un médicament de chimiothérapie, suggérant que l'emplacement de l'insertion influençait directement le comportement de la cellule.

L'aspect le plus surprenant de ce travail est peut-être ce qui est arrivé à l'ADN qui a été éliminé. Dans les méthodes précédentes, l'ADN qui n'était pas la cible était jeté ou rendu inutile. Dans ce nouveau système, parce que l'ADN indésirable est éliminé proprement plutôt que d'être simplement ignoré, il peut être sauvegardé et séquencé aux côtés de la cible. Les chercheurs ont montré que cet ADN « résiduel » pouvait être utilisé pour construire une carte complète du génome de la cellule cancéreuse, révélant des changements à grande échelle, tels que la perte d'un chromosome entier, qui se sont produits au fur et à mesure de la croissance des cellules. Cela signifie qu'une seule expérience peut désormais répondre à plusieurs questions : elle peut examiner un gène spécifique, observer ses marqueurs chimiques, suivre l'arrivée d'un virus et cartographier la structure de l'ensemble du génome, tout cela en même temps.

L'étude démontre qu'en changeant la façon dont nous préparons l'ADN pour le séquençage, nous pouvons obtenir beaucoup plus d'informations à partir de la même quantité de matière. La nouvelle méthode ne nécessite pas de quantités massives d'ADN de départ, ce qui est souvent une limitation lorsqu'on travaille avec des échantillons précieux de patients. Elle évite également l'amplification de l'ADN, une étape qui peut introduire des erreurs et effacer les marqueurs chimiques que les scientifiques tentent d'étudier. Bien que la méthode ait certaines limites, comme une taille maximale pour les fragments d'ADN qu'elle peut traiter, elle représente une étape importante pour rendre le séquençage de troisième génération pratique pour des questions biologiques complexes. En transformant un processus qui était autrefois un goulot d'étranglement en un flux de travail rationalisé, cette approche ouvre la voie à l'étude du génome de manières qui étaient auparavant trop lentes, trop coûteuses ou trop complexes à tenter.