High-coverage DNA sequence and modification profiling of targeted genomic elements using Nanopore-based Cas12a Targeted Ligation and Enrichment Sequencing (nCasTLES).

Imagina intentar leer una oración específica en una biblioteca que contiene miles de millones de libros, pero la única forma de leer es escaneando cada página de cada libro. Este es el desafío fundamental que enfrentan los científicos que utilizan un nuevo y potente tipo de tecnología de secuenciación de ADN llamada secuenciación de nanoporos. Este método es único porque puede leer largas hebras de ADN de un solo golpe y, lo que es crucial, puede ver etiquetas químicas en el ADN que actan como interruptores, encendiendo o apagando genes. Estas etiquetas son vitales para comprender enfermedades como el cáncer, pero la tecnología tiene un gran defecto: es lenta e ineficiente. Para encontrar las regiones genéticas específicas que le interesan a un científico, los métodos actuales a menudo dejan atrás vastas cantidades de ADN inútil e "inerte" que obstruye la máquina, desperdiciando tiempo y dinero mientras impide al investigador leer otra información importante en la misma muestra.

Un equipo de investigadores de la Escuela de Medicina de la Universidad de Massachusetts Chan ha desarrollado una nueva forma de resolver este problema, permitiendo a los científicos aislar exactamente el ADN que desean estudiar mientras mantienen el resto de la muestra limpia y útil. Llaman a su método nCasTLES. En lugar de dejar que el ADN no deseado se quede sentado en la máquina, este nuevo enfoque lo elimina físicamente antes de que comience la secuenciación. Al utilizar una herramienta molecular que actúa como un par de tijeras para cortar el ADN en puntos precisos, el equipo crea extremos pegajosos diminutos en el ADN objetivo. Luego, utilizan un sistema de captura similar a un imán para extraer solo esas piezas específicas de la mezcla, lavando el resto. Esto deja una muestra pura del ADN objetivo que puede secuenciarse junto con otros ADN de la misma muestra, duplicando efectivamente el valor del experimento.

Los investigadores probaron este método en un impulsor genético complejo encontrado en un tipo específico de línea celular de cáncer. Estas células contienen anillos adicionales de ADN, conocidos como ADN extracromosómico, que portan un alto número de copias de un gen peligroso del cáncer llamado MYCN. Utilizando su nueva técnica, el equipo pudo aislar estos anillos de ADN específicos del resto del material genético de la célula. Los resultados fueron impactantes: el nuevo método capturó casi cuarenta veces más ADN objetivo por hora en comparación con la secuenciación estándar sin enriquecimiento. Más importante aún, debido a que eliminaron el ADN inútil, la máquina funcionó durante más tiempo y de manera más saludable, produciendo una enorme cantidad de datos útiles. En una ejecución estándar, la máquina podría tener dificultades para leer cualquier otra cosa una vez que se encuentra el ADN objetivo, pero aquí, los investigadores también pudieron leer todo el genoma de las células cancerosas en la misma ejecución, revelando la estructura de esos anillos de ADN adicionales con alta precisión.

Para demostrar que el método funciona en un nivel más sutil, el equipo recurrió a un gen llamado MGMT, que a menudo es silenciado por etiquetas químicas en pacientes con un tumor cerebral mortal llamado glioblastoma. La capacidad de ver estas etiquetas sin destruir el ADN es una gran ventaja, ya que los métodos tradicionales requieren productos químicos agresivos que borran esta información. Los investigadores mezclaron ADN de dos líneas celulares de tumores cerebrales diferentes: una donde el gen estaba fuertemente etiquetado y silenciado, y otra donde no lo estaba. Utilizaron su nuevo método para extraer el gen de ambas líneas y secuenciarlos juntos. La máquina distinguió con éxito las dos líneas celulares basándose en diferencias genéticas diminutas y mapeó las etiquetas químicas en cada una de las hebras de ADN. Esto reveló que, si bien el gen estaba generalmente silenciado en una línea, había diferencias sutiles en cómo se disponían las etiquetas en comparación con la otra línea. El método incluso detectó hebras raras que parecían estar en medio de un cambio en su estado de etiqueta, un detalle que se habría perdido con las tecnologías de lectura más cortas y antiguas.

El poder de este enfoque se extiende más allá de solo encontrar genes conocidos. Los investigadores también utilizaron el método para rastrear dónde se había insertado un virus en el genoma humano, un proceso que ocurre de forma aleatoria y que a menudo se utiliza para estudiar cómo se comportan las células. Infectaron células con un lentivirus y luego utilizaron su método para pescar los lugares exacto donde el virus había aterrizado. Debido a que el método elimina el resto del ADN, pudieron ver el sitio de integración del virus y el ADN humano circundante en una sola pieza. Esto les permitió comparar diferentes grupos de células y ver que en algunas el virus aterrizó en partes activas del genoma, mientras que en otras aterrizó en áreas tranquilas e inactivas. Encontraron que las células con el virus en áreas activas crecían más rápido y eran más resistentes a un fármaco de quimioterapia, lo que sugiere que la ubicación de la inserción influyó directamente en el comportamiento de la célula.

Quizás el aspecto más sorprendente de este trabajo es lo que sucedió con el ADN que fue lavado. En los métodos anteriores, el ADN que no era el objetivo se descartaba o se volvía inútil. En este nuevo sistema, debido a que el ADN no deseado se elimina limpiamente en lugar de simplemente ignorarse, puede guardarse y secuenciarse junto con el objetivo. Los investigadores demostraron que este ADN "desecho" podía utilizarse para construir un mapa completo del genoma de la célula cancerosa, revelando cambios a gran escala, como la pérdida de un cromosoma entero, que ocurrieron a medida que las células crecían. Esto significa que un solo experimento puede ahora responder múltiples preguntas: puede observar un gen específico, ver sus etiquetas químicas, rastrear dónde aterrizó un virus y mapear la estructura de todo el genoma, todo a la vez.

El estudio demuestra que, al cambiar la forma en que preparamos el ADN para la secuenciación, podemos obtener mucha más información de la misma cantidad de material. El nuevo método no requiere cantidades masivas de ADN inicial, lo cual es a menudo una limitación cuando se trabaja con muestras preciosas de pacientes. También evita la necesidad de amplificar el ADN, un paso que puede introducir errores y borrar las etiquetas químicas que los científicos intentan estudiar. Aunque el método tiene algunas limitaciones, como un tamaño máximo para los fragmentos de ADN que puede manejar, representa un paso significativo hacia la práctica de la secuenciación de tercera generación para preguntas biológicas complejas. Al convertir un proceso que antes era un cuello de botella en un flujo de trabajo optimizado, este enfoque abre la puerta al estudio del genoma de formas que anteriormente eran demasiado lentas, demasiado costosas o demasiado complicadas de intentar.