High-coverage DNA sequence and modification profiling of targeted genomic elements using Nanopore-based Cas12a Targeted Ligation and Enrichment Sequencing (nCasTLES).

수십억 권의 책이 있는 도서관에서 특정 문장을 읽으려고 노력한다고 상상해 보십시오. 하지만 유일한 방법은 모든 책의 모든 페이지를 하나하나 다 스캔하는 것뿐입니다. 이것이 바로 과학자들이 '나노포어 시퀀싱(nanopore sequencing)'이라 불리는 강력하고 새로운 유형의 DNA 시퀀싱 기술을 사용할 때 직면하는 근본적인 과제입니다. 이 방식은 한 번에 긴 DNA 가닥을 읽을 수 있고, 결정적으로 유전자의 스위치를 켜고 끄는 역할을 하는 화학적 태그를 볼 수 있다는 점에서 독특합니다. 이러한 태그는 암과 같은 질병을 이해하는 데 필수적이지만, 이 기술에는 큰 결함이 있습니다. 바로 느리고 비효율적이라는 점입니다. 과학자가 관심을 갖는 특정 유전 영역을 찾기 위해, 현재의 방식들은 종종 기계를 막아버리는 방대한 양의 쓸모없는 '불활성(inert)' DNA를 남겨두어 시간과 비용을 낭비하고 연구자가 동일한 샘플 내의 다른 중요한 정보를 읽는 것을 방해합니다.

매사추세츠 대학교 찬 의과대학(University of Massachusetts Chan Medical School)의 연구팀은 과학자들이 연구하고자 하는 정확한 DNA만을 분리해 내면서도 나머지 샘플은 깨끗하고 유용하게 유지할 수 있는 새로운 방법을 개발했습니다. 그들은 이 방법을 nCasTLES라고 부릅니다. 원치 않는 DNA를 기계 안에 그대로 두는 대신, 이 새로운 접근 방식은 시퀀싱이 시작되기 전에 이를 물리적으로 제거합니다. 정밀한 지점에서 DNA를 자르는 가위 역할을 하는 분자 도구를 사용함으로써, 연구팀은 표적 DNA에 아주 작고 끈적한 끝(sticky ends)을 만듭니다. 그런 다음 자기와 같은 포획 시스템을 사용하여 혼합물에서 오직 해당 조각들만을 끌어당기고 나머지는 씻어냅니다. 이는 순수한 표적 DNA 샘플을 남겨주어, 동일한 샘플 내의 다른 DNA와 함께 시퀀싱할 수 있게 함으로써 실험의 가치를 실질적으로 두 배로 높여줍니다.

연구진은 이 방법을 특정 암 세포주에서 발견되는 복잡한 유전적 드라이버(genetic driver)에 적용하여 테스트했습니다. 이 세포들은 MYCN이라는 위험한 암 유전자의 복사본을 다량으로 보유한 '엑스트라크로모좀 DNA(extrachromosomal DNA)'라고 불리는 추가적인 DNA 고리들을 포함하고 있습니다. 이 새로운 기술을 사용하여 연구팀은 세포의 나머지 유전 물질로부터 이 특정 DNA 고리들을 분리해 낼 수 있었습니다. 결과는 놀라웠습니다. 이 새로운 방식은 농축 과정이 없는 표준 시퀀싱에 비해 시간당 표적 DNA를 거의 40배 더 많이 포착했습니다. 더 중요한 것은, 쓸모없는 DNA를 제거했기 때문에 기계가 더 오래, 더 건강하게 작동하여 방대한 양의 유용한 데이터를 생성했다는 점입니다. 표준 실행 방식에서는 표적 DNA를 찾고 나면 기계가 다른 것을 읽는 데 어려움을 겪을 수 있지만, 여기서는 연구자들이 동일한 실행 과정에서 암 세포의 전체 게놈(genome) 또한 읽을 수 있었으며, 이를 통해 그 추가 DNA 고리들의 구조를 높은 정밀도로 밝혀냈습니다.

이 방법이 더 미묘한 수준에서도 작동함을 증명하기 위해, 연구팀은 치명적인 뇌종양인 교모세포종(glioblastoma) 환자들에게서 흔히 유전자가 화학적 태그에 의해 침묵(silenced)되는 MGMT라는 유전자를 조사했습니다. DNA를 파괴하지 않고 이러한 태그를 관찰할 수 있는 능력은 큰 장점인데, 기존 방식들은 이 정보를 지워버리는 가혹한 화학 물질을 필요로 하기 때문입니다. 연구진은 유전자가 심하게 태깅되어 침묵된 세포주와 그렇지 않은 세포주의 DNA를 두 종류의 서로 다른 뇌종양 세포주로부터 혼합했습니다. 그들은 이 새로운 방법을 사용하여 두 세포주 모두에서 해당 유전자를 추출하고 함께 시퀀싱했습니다. 기계는 미세한 유전적 차이를 바탕으로 두 세포주를 성공적으로 구별해 냈으며, 모든 DNA 가닥에 있는 화학적 태그를 지도화했습니다. 이를 통해 한 세포주에서는 유전자가 전반적으로 침묵되어 있는 반면, 다른 세포주와 비교했을 때 태그가 배열된 방식에 미묘한 차이가 있음을 밝혀냈습니다. 이 방식은 심지어 태그 상태가 변화하는 중간 단계에 있는 희귀한 가닥들까지도 포착해 냈는데, 이는 기존의 짧은 읽기(short-read) 기술로는 놓쳤을 세부 사항이었습니다.

이 접근 방식의 힘은 단지 알려진 유전자를 찾는 것에 그치지 않습니다. 연구진은 또한 바이러스가 인간 게놈의 어디에 삽입되었는지 추적하는 데 이 방법을 사용했는데, 이는 무작위로 일어나는 과정이며 세포가 어떻게 행동하는지 연구하는 데 자주 사용됩니다. 그들은 렌티바이러스(lentivirus)에 세포를 감염시킨 후, 이 방법을 사용하여 바이러스가 착륙한 정확한 지점을 낚아 올렸습니다. 이 방법을 통해 나머지 DNA를 제거함으로써, 그들은 바이러스의 통합 부위(integration site)와 주변의 인간 DNA를 한 번에 볼 수 있었습니다. 이를 통해 연구진은 서로 다른 세포 그룹을 비교하여 어떤 세포는 활발한 유전 영역에 바이러스가 착륙한 반면, 다른 세포는 조용하고 비활성인 영역에 착륙했음을 확인할 수 있었습니다. 그들은 바이러스가 활성 영역에 위치한 세포들이 더 빠르게 성장하고 화학 요법 약물에 더 잘 저항한다는 것을 발견했으며, 이는 삽입 위치가 세포의 행동에 직접적인 영향을 미친다는 점을 시사합니다.

이 연구에서 가장 놀라운 측면 중 하나는 씻겨 나간 DNA에 일어난 일입니다. 이전 방식에서는 표적이 아닌 DNA가 버려지거나 쓸모없게 되었습니다. 그러나 이 새로운 시스템에서는, 원치 않는 DNA가 단순히 무시되는 것이 아니라 깨끗하게 제거되기 때문에, 이를 보존하여 표적과 함께 시퀀싱할 수 있습니다. 연구진은 이 "폐기물" DNA가 암 세포의 게놈 전체를 구성하는 지도를 만드는 데 사용될 수 있음을 보여주었으며, 이를 통해 세포가 성장함에 따라 발생하는 염색체 전체의 소실과 같은 대규모 변화를 밝혀냈습니다. 이는 단 한 번의 실험으로 이제 여러 질문에 답할 수 있음을 의미합니다: 특정 유전자를 살펴보고, 화학적 태그를 확인하며, 바이러스가 어디에 착륙했는지 추적하고, 전체 게놈의 구조를 동시에 매핑할 수 있습니다.

이 연구는 DNA를 준비하는 방식을 바꿈으로써 동일한 양의 재료로부터 훨씬 더 많은 정보를 얻을 수 있음을 입증합니다. 이 새로운 방법은 귀중한 환자 샘플을 다룰 때 흔히 제한 요소가 되는 대량의 시작 DNA를 요구하지 않습니다. 또한 DNA를 증폭하는 단계—이 단계는 오류를 유발하거나 과학자들이 연구하려는 화학적 태그를 지워버릴 수 있음—를 피합니다. 이 방법에는 처리할 수 있는 DNA 단편의 최대 크기와 같은 몇 가지 한계가 있지만, 이는 제3세대 시퀀싱을 복잡한 생물학적 질문에 실용적으로 만드는 데 있어 중요한 진전입니다. 이 과정을 한때 병목 현상이었던 것에서 효율적인 워크플로우로 전환함으로써, 이 접근 방식은 이전에는 너무 느리거나, 너무 비싸거나, 혹은 너무 복잡하여 시도하기 어려웠던 방식으로 게놈을 연구할 수 있는 문을 열어주고 있습니다.