High-coverage DNA sequence and modification profiling of targeted genomic elements using Nanopore-based Cas12a Targeted Ligation and Enrichment Sequencing (nCasTLES).

Stellen Sie sich vor, Sie versuchen, einen bestimmten Satz in einer Bibliothek mit Milliarden von Büchern zu lesen, aber der einzige Weg zu lesen besteht darin, jede einzelne Seite jedes einzelnen Buches zu scannen. Dies ist die grundlegende Herausforderung, vor der Wissenschaftler stehen, die eine leistungsstarke neue Art der DNA-Sequenzierungstechnologie namens Nanoporen-Sequenzierung verwenden. Diese Methode ist einzigartig, da sie lange DNA-Stränge in einem Durchgang lesen kann und – entscheidend – chemische Markierungen auf der DNA erkennen kann, die wie Schalter fungieren und Gene an- oder ausschalten. Diese Markierungen sind entscheidend für das Verständnis von Krankheiten wie Krebs, aber die Technologie hat einen großen Makel: Sie ist langsam und ineffizient. Um die spezifischen genetischen Regionen zu finden, die ein Wissenschaftler sucht, lassen aktuelle Methoden oft riesige Mengen an nutzloser, „inerter“ DNA zurück, die die Maschine verstopft, was Zeit und Geld verschwendet und den Forscher daran hindert, andere wichtige Informationen in derselben Probe zu lesen.

Ein Forschungsteam der University of Massachusetts Chan Medical School hat einen neuen Weg entwickelt, um dieses Problem zu lösen, indem es Wissenschaftlern ermöglicht, genau die DNA zu isolieren, die sie untersuchen wollen, während der Rest der Probe sauber und nutzbar bleibt. Sie nennen ihre Methode nCasTLES. Anstatt die unerwünschte DNA in der Maschine zu lassen, entfernt dieser neue Ansatz sie physisch, bevor die Sequenzierung beginnt. Durch die Verwendung eines molekularen Werkzeugs, das wie eine Schere fungiert und die DNA an präzisen Stellen schneidet, erzeugt das Team winzige, klebrige Enden an der Ziel-DNA. Dann nutzen sie ein magnetähnliches Erfassungssystem, um nur diese spezifischen Stücke aus dem Gemisch herauszuziehen und den Rest wegzuspülen. Dies hinterlässt eine reine Probe der Ziel-DNA, die zusammen mit der restlichen DNA aus derselben Probe sequenziert werden kann, was den Wert des Experiments effektiv verdoppelt.

Die Forscher testeten diese Methode an einem komplexen genetischen Treiber, der in einer spezifischen Krebszelllinie vorkommt. Diese Zellen enthalten zusätzliche DNA-Ringe, bekannt als extrachromosomale DNA, die eine hohe Anzahl von Kopien eines gefährlichen Krebsgens namens MYCN tragen. Mit dieser neuen Technik gelang es dem Team, diese spezifischen DNA-Ringe vom restlichen genetischen Material der Zelle zu isolieren. Die Ergebnisse waren beeindruckend: Die neue Methode erfasste fast vierzigmal mehr der Ziel-DNA pro Stunde im Vergleich zur Standardsequenzierung ohne Anreicherung. Viel wichtiger war, dass die Maschine, weil sie die nutzlose DNA entfernt hatte, länger und gesünder lief und eine massive Menge an nützlicher Daten produzierte. In einem Standardlauf könnte die Maschine Schwierigkeiten haben, irgendet etwas anderes zu lesen, sobald die Ziel-DNA gefunden wurde, aber hier konnten die Forscher auch das gesamte Genom der Krebszellen im selben Durchgang lesen und so die Struktur jener zusätzlichen DNA-Ringe mit hoher Präzision aufdecken.

Um zu beweisen, dass die Methode auch auf einer subtileren Ebene funktioniert, wandte sich das Team einem Gen namens MGMT zu, das bei Patienten mit einem tödlichen Hirntumor namens Glioblastom oft durch chemische Markierungen abgeschaltet ist. Die Fähigkeit, diese Markierungen zu sehen, ohne die DNA zu zerstören, ist ein großer Vorteil, da traditionelle Methoden harte Chemikalien erfordern, die diese Information löschen. Die Forscher mischten DNA aus zwei verschiedenen Hirntumorzelllinien: einer, in der das Gen stark markiert und abgeschaltet war, und einer, in der dies nicht der Fall war. Sie verwendeten ihre neue Methode, um das Gen aus beiden Linien herauszufischen und sie zusammen zu sequenzieren. Die Maschine konnte die beiden Zelllinien anhand winziger genetischer Unterschiede erfolgreich unterscheiden und die chemischen Markierungen auf jedem einzelnen DNA-Strang kartieren. Dies zeigte, dass das Gen in einer Linie zwar generell abgeschaltet war, es aber subtile Unterschiede in der Anordnung der Markierungen im Vergleich zur anderen Linie gab. Die Methode entdeckte sogar seltene Stränge, die sich scheinbar mitten in der Änderung ihres Markierungsstatus befanden – ein Detail, das mit älteren Technologien mit kürzeren Lesevorgängen übersehen worden wäre.

Die Kraft dieses Ansatzes erstreckt sich über das bloße Finden bekannter Gene hinaus. Die Forscher nutzten die Methode auch, um zu verfolgen, wo ein Virus in das menschliche Genom inseriert hatte – ein Prozess, der zufällig abläuft und oft genutzt wird, um das Verhalten von Zellen zu untersuchen. Sie infizierten Zellen mit einem Lentivirus und nutzten dann ihre Methode, um die exakten Stellen aufzuspüren, an denen das Virus gelandet war. Da die Methode den Rest der DNA entfernt, konnten sie die Insertionsstelle des Virus und die umliegende menschliche DNA in einem Stück sehen. Dies ermöglichte es ihnen, verschiedene Zellgruppen zu vergleichen und festzustellen, dass das Virus bei einigen in aktiven Teilen des Genoms landete, während es bei anderen in ruhigen, inaktiven Bereichen landete. Sie fanden heraus, dass Zellen mit dem Virus in aktiven Bereichen schneller wuchsen und resistenter gegen ein Chemotherapeutikum waren, was darauf hindeutet, dass der Ort der Insertion das Verhalten der Zelle direkt beeinflusste.

Der vielleicht überraschendste Aspekt dieser Arbeit war das, was mit der DNA geschah, die weggewaschen wurde. In früheren Methoden wurde die DNA, die nicht das Ziel war, verworfen oder unbrauchbar gemacht. In diesem neuen System kann die „Abfall“-DNA, da sie sauber entfernt und nicht nur ignoriert wird, bewahrt und zusammen mit der Ziel-DNA sequenziert werden. Die Forscher zeigten, dass diese „Abfall“-DNA verwendet werden konnte, um eine vollständige Karte des Krebszellgenoms zu erstellen, die großflächige Veränderungen aufdeckte, wie etwa den Verlust eines gesamten Chromosoms, der während des Wachstums der Zellen auftrat. Das bedeutet, dass ein einziges Experiment nun mehrere Fragen beantworten kann: Es kann ein spezifisches Gen untersuchen, seine chemischen Markierungen betrachten, verfolgen, wo ein Virus gelandet ist, und gleichzeitig die gesamte Genomstruktur kartieren.

Die Studie zeigt, dass wir durch die Änderung der Art und Weise, wie wir DNA für die Sequenzierung vorbereiten, aus derselben Menge an Material viel mehr Informationen gewinnen können. Die neue Methode benötigt keine massiven Mengen an Ausgangs-DNA, was oft eine Einschränkung bei der Arbeit mit kostbaren Patientenproben ist. Sie vermeidet auch die Notwendigkeit, die DNA zu amplifizieren – ein Schritt, der Fehler einführen und die chemischen Markierungen, die Wissenschaftler untersuchen wollen, löschen kann. Obwohl die Methode gewisse Grenzen hat, wie etwa eine maximale Größe der DNA-Fragmente, die sie handhaben kann, stellt sie einen bedeutenden Fortschritt dar, um die Third-Generation-Sequenzierung für komplexe biologische Fragestellungen praktikabel zu machen. Indem sie einen Prozess, der einst ein Engpass war, in einen optimierten Arbeitsablauf verwandelt, öffnet dieser Ansatz die Tür dazu, das Genom auf eine Weise zu untersuchen, die zuvor zu langsam, zu teuer oder zu unordentlich gewesen wäre.