High-coverage DNA sequence and modification profiling of targeted genomic elements using Nanopore-based Cas12a Targeted Ligation and Enrichment Sequencing (nCasTLES).

कल्पना कीजिए कि आप अरबों किताबों वाले पुस्तकालय में एक विशिष्ट वाक्य को पढ़ने की कोशिश कर रहे हैं, लेकिन एकमात्र तरीका यह है कि हर एक किताब के हर एक पन्ने को स्कैन किया जाए। यह उस वैज्ञानिक चुनौती का मूल है जिसका सामना वे वैज्ञानिक कर रहे हैं जो नैनोपोर सीक्वेंसिंग (nanopore sequencing) नामक एक शक्तिशाली नए प्रकार की डीएनए सीक्वेंसिंग तकनीक का उपयोग करते हैं। यह विधि इसलिए अद्वितीय है क्योंकि यह एक बार में डीएनए के लंबे स्ट्रैंड्स को पढ़ सकती है और, महत्वपूर्ण रूप से, यह डीएनए पर रासायनिक टैग देख सकती है जो स्विच की तरह काम करते हैं, जिससे जीन चालू या बंद होते हैं। ये टैग कैंसर जैसी बीमारियों को समझने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण हैं, लेकिन इस तकनीक में एक बड़ी खामी है: यह धीमी और अक्षम है। वैज्ञानिकों को जिन विशिष्ट आनुवंशिक क्षेत्रों को खोजने की आवश्यकता होती है, उन्हें खोजने के लिए वर्तमान विधियाँ अक्सर बहुत सारा बेकार, "निष्क्रिय" डीएनए पीछे छोड़ देती हैं जो मशीन को जाम कर देता है, जिससे समय और पैसा बर्बाद होता है और शोधकर्ता उसी नमूने में अन्य महत्वपूर्ण जानकारी नहीं पढ़ पाते हैं।

मैसाचुसेट्स de チャन मेडिकल स्कूल के शोधकर्ताओं की एक टीम ने इस समस्या को हल करने का एक नया तरीका विकसित किया है, जिससे वैज्ञानिक ठीक उसी डीएनए को अलग कर सकते हैं जिसका वे अध्ययन करना चाहते हैं, जबकि बाकी नमूने को साफ और उपयोगी रखते हैं। वे अपनी इस विधि को nCasTLES कहते हैं। अनचाहे डीएनए को मशीन में छोड़ने के बजाय, यह नया दृष्टिकोण सीक्वेंसिंग शुरू होने से पहले ही उसे भौतिक रूप से हटा देता है। डीएनए को सटीक स्थानों पर काटने के लिए कैंची की तरह काम करने वाले एक आणविक उपकरण का उपयोग करके, टीम लक्षित डीएनए पर छोटे, चिपचिपे सिरे (sticky ends) बनाती है। इसके बाद वे केवल उन विशिष्ट टुकड़ों को मिश्रण से बाहर निकालने के लिए एक चुंबकीय-समान कैप्चर सिस्टम का उपयोग करते हैं, और बाकी को धोकर निकाल देते हैं। इससे लक्षित डीएनए का एक शुद्ध नमूना प्राप्त होता जिसे उसी नमूने के अन्य डीएनए के साथ अनुक्रमित (sequence) किया जा सकता है, जिससे प्रयोग का मूल्य प्रभावी रूप से दोगुना हो जाता है।

शोधकर्ताओं ने इस विधि का परीक्षण एक विशिष्ट प्रकार की कैंसर कोशिका में पाए जाने वाले एक जटिल जेनेटिक ड्राइवर पर किया। इन कोशिकाओं में डीएनए के अतिरिक्त छल्ले होते हैं, जिन्हें एक्स्ट्राक्रोमोसोमल डीएनए (extrachromosomal DNA) कहा जाता है, जिनमें MYCN नामक एक खतरनाक कैंसर जीन की प्रतियों की उच्च संख्या होती है। अपनी नई तकनीक का उपयोग करके, टीम ने शेष कोशिकीय आनुवंशिक सामग्री से इन विशिष्ट डीएनए छल्लों को अलग करने में सफलता प्राप्त की। परिणाम आश्चर्यजनक थे: नई विधि ने मानक सीक्वेंसिंग की तुलना में प्रति घंटा लगभग चालीस गुना अधिक लक्षित डीएनए कैप्चर किया। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि चूंकि उन्होंने बेकार डीएनए को हटा दिया था, इसलिए मशीन अधिक समय तक और बेहतर ढंग से चली, जिससे डेटा की एक विशाल मात्रा प्राप्त हुई। एक मानक रन में, मशीन लक्षित डीएनए मिलने के बाद कुछ भी अन्य पढ़ने में संघर्ष कर सकती है, लेकिन यहाँ, शोधकर्ता एक ही रन में कैंसर कोशिकाओं के संपूर्ण जीनोम को भी पढ़ सके, जिससे उन अतिरिक्त डीएनए छल्लों की संरचना का उच्च सटीकता के साथ पता चला।

यह सिद्ध करने के लिए कि यह विधि अधिक सूक्ष्म स्तर पर कैसे काम करती है, टीम ने MGMT नामक जीन की ओर रुख किया, जो ग्लियोब्लास्टोमा (glioblastoma) नामक घातक मस्तिष्क ट्यूमर वाले रोगियों में अक्सर रासायनिक टैग द्वारा शांत (silenced) कर दिया जाता है। डीएनए को नष्ट किए बिना इन टैगों को देखने की क्षमता एक बड़ा लाभ है, क्योंकि पारंपरिक विधियों के लिए ऐसे कठोर रसायनों की आवश्यकता होती है जो इस जानकारी को मिटा देते हैं। शोधकर्ताओं ने दो अलग-अलग ब्रेन ट्यूमर सेल लाइनों के डीएनए को मिलाया: एक जहाँ जीन अत्यधिक टैग किया गया और शांत था, और दूसरी जहाँ वह नहीं था। उन्होंने दोनों लाइनों से जीन को बाहर निकालने के लिए अपनी नई विधि का उपयोग किया और उन्हें एक साथ अनुक्रमित किया। मशीन ने सूक्ष्म आनुवंशिक अंतरों के आधार पर दोनों सेल लाइनों के बीच सफलतापूर्वक अंतर किया और प्रत्येक डीएनए स्ट्रैंड पर रासायनिक टैग का मानचित्रण किया। इसने खुलासा किया कि जबकि एक लाइन में जीन आम तौर पर शांत था, दूसरी लाइन की तुलना में टैग के व्यवस्थित होने के तरीके में सूक्ष्म अंतर थे। विधि ने उन दुर्लभ स्ट्रैंड्स को भी पहचाना जो अपने टैग की स्थिति बदलने के बीच में थे, एक ऐसा विवरण जो पुरानी, छोटी-रीड (short-read) तकनीकों से छूट जाता।

इस दृष्टिकोण की शक्ति केवल ज्ञात जीनों को खोजने तक ही सीमित नहीं है। शोधकर्ताओं ने एक वायरस ने मानव जीनोम में खुद को कहाँ डाला है, इसका पता लगाने के लिए भी इस विधि का उपयोग किया, जो एक यादृच्छिक प्रक्रिया है और जिसका उपयोग अक्सर यह अध्ययन करने के लिए किया जाता है कि कोशिकाएं कैसे व्यवहार करती हैं। उन्होंने कोशिकाओं को लेंटिविरस (lentivirus) से संक्रमित किया और फिर उस सटीक स्थान को खोजने के लिए अपनी विधि का उपयोग किया जहाँ वायरस पहुँचा था। क्योंकि यह विधि शेष डीएनए को हटा देती है, वे वायरस के एकीकरण स्थल (integration site) और आसपास के मानव डीएनए को एक ही टुकड़े में देख सके। इससे उन्हें विभिन्न समूहों की कोशिकाओं की तुलना करने और यह देखने में मदद मिली कि कुछ कोशिकाओं में वायरस सक्रिय भागों में पहुँचा, जबकि अन्य में यह शांत, निष्क्रिय क्षेत्रों में पहुँचा। उन्होंने पाया कि सक्रिय क्षेत्रों में वायरस वाले कोशिकाओं ने तेजी से वृद्धि की और कीमोथेरेपी दवा के प्रति अधिक प्रतिरोधी थे, जिससे पता चलता है कि सम्मिलन (insertion) का स्थान सीधे कोशिका के व्यवहार को प्रभावित करता है।

इस कार्य का सबसे आश्चर्यजनक पहलू वह था जो धुले हुए डीएनए के साथ हुआ। पिछली विधियों में, वह डीएनए जो लक्ष्य नहीं था, उसे या तो त्याग दिया जाता था या बेकार कर दिया जाता था। इस नई प्रणाली में, क्योंकि अनचाहे डीएनए को केवल अनदेखा करने के बजाय सफाई से हटाया जाता है, इसलिए इसे बचाया जा सकता है और लक्षित डीएनए के साथ अनुक्रमित किया जा सकता है। शोधकर्ताओं ने दिखाया कि इस "अपशिष्ट" डीएनए का उपयोग कैंसर कोशिका के संपूर्ण जीनोम का एक पूर्ण मानचित्र बनाने के लिए किया जा सकता है, जिससे बड़े पैमाने पर परिवर्तन प्रकट होते हैं, जैसे कि एक पूरे गुणसूत्र (chromosome) का नुकसान, जो कोशिकाओं के बढ़ने के दौरान हुआ था। इसका मतलब है कि एक एकल प्रयोग अब कई प्रश्नों के उत्तर दे सकता है: यह एक विशिष्ट जीन को देख सकता है, इसके रासायनिक टैग देख सकता है, वायरस कहाँ पहुँचा उसका पता लगा सकता है, और एक साथ पूरे जीनोम की संरचना का मानचित्रण कर सकता है।

यह अध्ययन प्रदर्शित करता है कि सीक्वेंसिंग के लिए डीएनए तैयार करने के तरीके को बदलकर, हम समान मात्रा में सामग्री से बहुत अधिक जानकारी प्राप्त कर सकते हैं। इस नई विधि के लिए बहुत अधिक मात्रा में शुरुआती डीएनए की आवश्यकता नहीं होती है, जो अक्सर कीमती रोगी नमूनों के साथ काम करते समय एक सीमा होती है। यह डीएनए को प्रवर्धित (amplify) करने की आवश्यकता से भी बचता है, जो एक ऐसा चरण है जो त्रुटियां पेश कर सकता है और उन रासायनिक टैग को मिटा सकता है जिनका अध्ययन वैज्ञानिक करना चाहते हैं। हालांकि इस विधि की कुछ सीमाएं हैं, जैसे कि इसके द्वारा संभाले जा जाने वाले डीएनए खंडों का अधिकतम आकार, फिर भी यह जटिल जैविक प्रश्नों के लिए थर्ड-जेनरेशन सीक्वेंसिंग को व्यावहारिक बनाने की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है। एक ऐसी प्रक्रिया को, जो कभी बाधा (bottleneck) थी, एक सुव्यवस्थित वर्कफ़्लो में बदलकर, यह दृष्टिकोण जीनोम का अध्ययन करने के ऐसे तरीके खोलता है जो पहले बहुत धीमे, बहुत महंगे या बहुत अव्यवस्थित थे।