High-coverage DNA sequence and modification profiling of targeted genomic elements using Nanopore-based Cas12a Targeted Ligation and Enrichment Sequencing (nCasTLES).

Imagine tentar ler uma frase específica em uma biblioteca contendo bilhões de livros, mas a única maneira de ler é escanear cada página de cada livro. Este é o desafio fundamental enfrentado por cientistas que utilizam um novo e poderoso tipo de tecnologia de sequenciamento de DNA chamada sequenciamento por nanoporos. Este método é único porque pode ler longas fitas de DNA de uma só vez e, crucialmente, pode ver etiquetas químicas no DNA que atuam como interruptores, ligando ou desligando genes. Essas etiquetas são vitais para entender doenças como o câncer, mas a tecnologia tem uma falha importante: é lenta e ineficiente. Para encontrar as regiões genéticas específicas de que um cientista precisa, os métodos atuais frequentemente deixam para trás vastas quantidades de DNA inútil e "inerte" que entope a máquina, desperdiçando tempo e dinheiro, enquanto impede o pesquisador de ler outras informações importantes na mesma amostra.

Uma equipe de pesquisadores da Escola de Medicina da Universidade de Massachusetts Chan desenvolveu uma nova maneira de resolver este problema, permitindo que os cientistas isolem exatamente o DNA que desejam estudar, mantendo o restante da amostra limpo e útil. Eles chamam seu método de nCasTLES. Em vez de deixar o DNA indesejado parado na máquina, esta nova abordagem o remove fisamente antes do início do sequenciamento. Ao usar uma ferramenta molecular que atua como uma tesoura para cortar o DNA em pontos precisos, a equipe cria extremidades adesivas minúsculas no DNA alvo. Eles então usam um sistema de captura semelhante a um ímã para puxar apenas essas peças específicas do meio, lavando o restante. Isso deixa uma amostra pura do DNA alvo que pode ser sequenciada ao lado de outro DNA da mesma amostra, efetivamente dobrando o valor do experimento.

Os pesquisadores testaram este método em um driver genético complexo encontrado em uma linhagem específica de células cancerígenas. Essas células contêm anéis extras de DNA, conhecidos como DNA extracromossômico, que carregam um alto número de cópias de um gene cancerígeno perigoso chamado MYCN. Usando essa nova técnica, a equipe foi capaz de isolar esses anéis de DNA específicos do restante do material genético da célula. Os resultados foram impressionantes: o novo método capturou quase quarenta vezes mais do DNA alvo por hora em comparação com o sequenciamento padrão sem enriquecimento. Mais importante ainda, porque removeram o DNA inútil, a máquina funcionou por mais tempo e de forma mais saudável, produzindo uma quantidade massiva de dados úteis. Em uma execução padrão, a máquina poderia ter dificuldade em ler qualquer outra coisa assim que o DNA alvo fosse encontrado, mas aqui, os pesquisadores também puderam ler todo o genoma das células cancerígenas na mesma execução, revelando a estrutura desses anéis de DNA extras com alta precisão.

Para provar que o método funciona em um nível mais sutil, a equipe recorreu a um gene chamado MGMT, que é frequentemente silenciado por etiquetas químicas em pacientes com um tumor cerebral mortal chamado glioblastoma. A capacidade de ver essas etiquetas sem destruir o DNA é uma grande vantagem, pois os métodos tradicionais exigem produtos químicos agressivos que apagam essa informação. Os pesquisadores misturaram DNA de duas linhagens diferentes de células de tumor cerebral: uma onde o gene estava fortemente etiquetado e silenciado, e outra onde não estava. Eles usaram seu novo método para extrair o gene de ambas as linhagens e sequenciá-los juntos. A máquina distinguiu com sucesso as duas linhagens de células com base em diferenças genéticas minúsculas e mapeou as etiquetas químicas em cada única fita de DNA. Isso revelou que, embora o gene estivesse geralmente silenciado em uma linhagem, havia diferenças sutis na forma como as etiquetas estavam organizadas em comparação com a outra. O método até detectou fitas raras que pareciam estar no meio de uma mudança de status de suas etiquetas, um detalhe que teria sido perdido pelas tecnologias mais antigas de leitura curta.

O poder desta abordagem estende-se além de apenas encontrar genes conhecidos. Os pesquisadores também usaram o método para rastrear onde um vírus havia se inserido no genoma humano, um processo que acontece aleatoriamente e é frequentemente usado para estudar como as células se comportam. Eles infectaram células com um lentivírus e então usaram seu método para pescar os locais exatos onde o vírus havia pousado. Como o método remove o restante do DNA, eles puderam ver o local de integração do vírus e o DNA humano circundante em uma única peça. Isso permitiu que comparassem diferentes grupos de células e vissem que algumas tinham o vírus pousado em partes ativas do genoma, enquanto outras o tinham em áreas silenciosas e inativas. Eles descobriram que as células com o vírus em áreas ativas cresciam mais rápido e eram mais resistentes a um medicamento quimioterápico, sugerindo que a localização da inserção influenciava diretamente o comportamento da célula.

Talvez o aspecto mais surpreendente deste trabalho seja o que aconteceu com o DNA que foi lavado para fora. Em métodos anteriores, o DNA que não era o alvo era descartado ou tornado inútil. Neste novo sistema, como o DNA indesejado é removido de forma limpa, em vez de ser apenas ignorado, ele pode ser salvo e sequenciado junto com o alvo. Os pesquisadores mostraram que esse DNA de "descarte" poderia ser usado para construir um mapa completo do genoma da célula cancerígena, revelando mudanças de grande escala, como a perda de um cromossomo inteiro, que ocorreu conforme as células cresciam. Isso significa que um único experimento pode agora responder a múltiplas perguntas: pode observar um gene específico, ver suas etiquetas químicas, rastrear onde um vírus pousou e mapear a estrutura de todo o genoma, tudo ao mesmo tempo.

O estudo demonstra que, ao mudar a forma como preparamos o DNA para o sequenciamento, podemos obter muito mais informação a partir da mesma quantidade de material. O novo método não requer quantidades massivas de DNA inicial, o que é frequentemente uma limitação ao trabalhar com amostras preciosas de pacientes. Ele também evita a necessidade de amplificar o DNA, um passo que pode introduzir erros e apagar as etiquetas químicas que os cientistas estão tentando estudar. Embora o método tenha algumas limitações, como um tamanho máximo para os fragmentos de DNA que pode manipular, ele representa um passo significativo para tornar o sequenciamento de terceira geração prático para questões biológicas complexas. Ao transformar um processo que antes era um gargalo em um fluxo de trabalho otimizado, esta abordagem abre as portas para o estudo do genoma de maneiras que anteriormente eram muito lentas, caras ou desorganizadas para serem tentadas.