High-coverage DNA sequence and modification profiling of targeted genomic elements using Nanopore-based Cas12a Targeted Ligation and Enrichment Sequencing (nCasTLES).

Immagina di cercare di leggere una frase specifica in una biblioteca contenente miliardi di libri, ma l'unico modo per leggere sia quello di scansionare ogni singola pagina di ogni singolo libro. Questa è la sfida fondamentale che i ricercatori affrontano utilizzando un nuovo e potente tipo di tecnologia di sequenziamento del DNA chiamata sequenziamento a nanopori. Questo metodo è unico perché può leggere lunghi filamenti di DNA in un colpo solo e, cosa fondamentale, può vedere i tag chimici sul DNA che agiscono come interruttori, accendendo o spegnendo i geni. Questi tag sono vitali per comprendere malattie come il cancro, ma la tecnologia ha un grande difetto: è lenta ed inefficiente. Per trovare le regioni genetiche specifiche che interessano a uno scienziato, i metodi attuali spesso lasciano dietro di sé enormi quantità di DNA inutile e "inerte" che intasa la macchina, sprecando tempo e denaro e impedendo al ricercatore di leggere altre informazioni importanti nello stesso campione.

Un team di ricercatori della UMass Chan Medical School ha sviluppato un nuovo modo per risolvere questo problema, consentendo agli scienziati di isolare esattamente il DNA che vogliono studiare, mantenendo il resto del campione pulito e utile. Chiamano il loro metodo nCasTLES. Invece di lasciare il DNA indesiderato fermo nella macchina, questo nuovo approccio lo rimuove fisicamente prima che il sequenziamento inizi. Utilizzando uno strumento molecolare che agisce come un paio di forbici per tagliare il DNA in punti precisi, il team crea piccole estremità appiccicose sul DNA bersaglio. Successivamente, utilizzano un sistema di cattura simile a un magnete per estrarre solo quei pezzi specifici dal mix, lavando via tutto il resto. Ciò lascia un campione puro del DNA bersaglio che può essere sequenziato insieme ad altro DNA dello stesso campione, raddoppiando di fatto il valore dell'esperimento.

I ricercatori hanno testato questo metodo su un complesso driver genetico trovato in una specifica linea cellulare cancerosa. Queste cellule contengono anelli extra di DNA, noti come DNA extracromosomico, che trasportano un alto numero di copie di un pericoloso gene del cancro chiamato MYCN. Utilizzando la loro nuova tecnica, il team è stato in grado di isolare questi specifici anelli di DNA dal resto del materiale genetico della cellula. I risultati sono stati sorprendenti: il nuovo metodo ha catturato quasi quaranta volte più DNA bersaglio all'ora rispetto al sequenziamento standard senza arricchimento. Ancora più importante, poiché hanno rimosso il DNA inutile, la macchina è stata in grado di lavorare più a lungo e in modo più efficiente, producendo una quantità enorme di dati utili. In una corsa standard, la macchina potrebbe faticare a leggere qualsiasi altra cosa una volta trovato il DNA bersaglio, ma qui, i ricercatori hanno potuto leggere anche l'intero genoma delle cellule cancerose nello stesso ciclo, rivelando la struttura di quegli anelli di DNA extra con alta precisione.

Per dimostrare che il metodo funziona anche su un livello più sottile, il team si è rivolto a un gene chiamato MGMT, che viene spesso silenziato dai tag chimici nei pazienti con un tumore cerebrale mortale chiamato glioblastoma. La capacità di vedere questi tag senza distruggere il DNA è un grande vantaggio, poiché i metodi tradizionali richiedono sostanze chimiche aggressive che cancellano questa informazione. I ricercatori hanno mescolato il DNA di due diverse linee cellulari di tumore cerebrale: una in cui il gene era pesantemente taggato e silenziato, e un'altra in cui non lo era. Hanno usato il loro nuovo metodo per estrarre il gene da entrambe le linee e sequenziarli insieme. La macchina è riuscita a distinguere le due linee cellulari basandosi su minuscole differenze genetiche e ha mappato i tag chimici su ogni singolo filamento di DNA. Ciò ha rivelato che, mentre il gene era generalmente silenziato in una linea, c'erano sottili differenze nel modo in cui i tag erano disposti rispetto all'altra. Il metodo ha persino individuato rari filamenti che sembravano essere nel mezzo del cambiamento del proprio stato di tagging, un dettaglio che sarebbe sfuggito alle tecnologie più vecchie a lettura breve.

La potenza di questo approccio va oltre il semplice ritrovamento di geni noti. I ricercatori hanno anche utilizzato la tecnica per tracciare dove un virus si era inserito nel genoma umano, un processo che avviene casualmente ed è spesso usato per studiare come si comportano le cellule. Hanno infettato le cellule con un lentivirus e poi hanno usato il loro metodo per pescare gli esatti punti in cui il virus si era posato. Poiché il metodo rimuove il resto del DNA, potevano vedere il sito di integrazione del virus e il DNA umano circostante in un unico pezzo. Ciò ha permesso loro di confrontare diversi gruppi di cellule e vedere che alcune avevano il virus in parti attive del genoma, mentre altre lo avevano in aree calme e inattive. Hanno scoperto che le cellule con il virus in aree attive crescevano più velocemente ed erano più resistenti a un farmaco chemioterapico, suggerendo che la posizione dell'inserzione influenzava direttamente il comportamento della cellula.

Forse l'aspetto più sorprendente di questo lavoro è ciò che è accaduto al DNA che è stato lavato via. Nei metodi precedenti, il DNA che non era l'obiettivo veniva scartato o reso inutile. In questo nuovo sistema, poiché il DNA indesiderato viene rimosso pulitamente invece di essere semplicemente ignorato, può essere salvato e sequenziato insieme al bersaglio. I ricercatori hanno dimostrato che questo DNA "di scarto" poteva essere utilizzato per costruire una mappa completa del genoma della cellula cancerosa, rivelando cambiamenti su larga scala, come la perdita di un intero cromosoma, che avvenivano durante la crescita delle cellule. Ciò significa che un singolo esperimento può ora rispondere a molteplici domande: può esaminare un gene specifico, vedere i suoi tag chimici, tracciare dove è atterrato un virus e mappare la struttura dell'intero genoma tutto in una volta.

Lo studio dimostra che cambiando il modo in cui prepariamo il DNA per il sequenziamento, possiamo ottenere molte più informazioni dalla stessa quantità di materiale. Il nuovo metodo non richiede enormi quantità di DNA di partenza, che è spesso un limite quando si lavora con preziosi campioni di pazienti. Inoltre, evita la necessità di amplificare il DNA, un passaggio che può introdurre errori e cancellare i tag chimici che gli scienziati vogliono studiare. Sebbene il metodo abbia alcuni limiti, come una dimensione massima per i frammenti di DNA che può gestire, rappresenta un passo avanti significativo nel rendere il sequenziamento di terza generazione praticabile per questioni biologiche complesse. Trasformando un processo che un tempo era un collo di bottiglia in un flusso di lavoro snello, questo approccio apre la porta allo studio del genoma in modi che precedentemente erano troppo lenti, troppo costosi o troppo disordinati per essere tentati.