Enriching microlaser-labelled cells by commercial flow cytometry-based cell sorting systems
تُظهر هذه الدراسة أن عملية الفرز القائمة على قياس التدفق الخلوي التجاري، بالاقتران مع جسيمات البوليسترين الليزرية المعدلة سطحياً، تتيح الإثراء الفعال لخلايا HEK239T بأعداد محكومة من الليزرات الميكروية مع الحفاظ على حيوية الخلايا وتسهيل إنشاء كرويات متعددة الخلايا محددة لتطبيقات هندسة الأنسجة المتقدمة.
البحث الأصلي مرخَّص بموجب CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). هذا شرح مولَّده بالذكاء الاصطناعي لبحث مسبق لم يخضع لمراجعة الأقران. وهو ليس نصيحة طبية. لا تتخذ أي قرارات تتعلق بصحتك بناءً على هذا المحتوى. اقرأ إخلاء المسؤولية الكامل
ملخص تقني: إثراء الخلايا الملحومة بالميكروليزر عبر أنظمة قياس التدفق الخلوي التجارية القائمة على فرز الخلايا
بيان المشكلة
توفر ليزرات نمط الغرفة الهامسة (WGM)، وهي عادةً جسيمات بولي ستيرين (LPs) مطعمة بصبغة فلورية، مزايا فريدة للوسم الخلوي عالي الدقة، وتتبع الخلايا المفردة، والاستشعار الحيوي نظرًا لانبعاثها الساطع وضيق طيفها. ومع ذلك، توجد عقبة حرجة في تطبيق هذه الأدوات في سياقات الطب الحيوي وهندسة الأنسجة: وهي عدم القدرة على التحكم بشكل متكرر في عدد جسيمات (LPs) داخل مجتمع خلوي. وبينما يمكن تحديد آلاف الخلايا الموسومة في المزارع، فإن ضمان نقاء وتكوين محدد لمجتمع الخلايا الأساسي فيما يتعلق بكثافة وسم (LPs) يعد أمرًا ضروريًا للتطبيقات المتقدمة. وتعتمد الطرق الحالية لفرز الخلايا بناءً على الرموز الشريطية الطيفية لجسيمات (LPs) الممتصة داخليًا على أنظمة مائيات دقيقة (microfluidic) مصممة خصيصًا وأنظمة بصرية معقدة، والتي يصعب بناؤها وصيانتها وتشغيلها، مما يحد من إمكانية الوصول إليها إلا للمرافق المركزية المتخصصة.
المنهجية
طور المؤلفون سير عمل يستخدم أنظمة قياس التدفق الخلوي وفرز الخلايا التجارية المتاحة على نطاق واسع لتنقية مجتمعات الخلايا التي تحتوي على جسيمات (LPs) كبيرة دون الحاجة إلى مائيات دقيقة مخصصة.
- اختيار وتوصيف الجسيمات: تمت مقارنة نوعين من جسيمات (LPs) التجارية (LP-A و LP-B). وتم توصيف أداء الليزر، وسطوع الفلورة الضوئية (PL)، وتوزيع الحجم، والانتظام لكل منهما باستخدام الضخ البصري، وقياس التدفق الخلوي (FSC-A, SSC-A, Red-PL)، والمجهر ذو المجال المضيء.
- تعديل السطح: لتعزيز ارتباط (LPs) بالخلايا، تم تعديل أسطح (LPs) باستخدام البولي إيثيلين إيمين (PEI) أو الليبوفيكتامين لعكس شحنة السطح من السالبة إلى الموجبة، مما يعزز التفاعل مع غشاء الخلية سالب الشحنة.
- استراتيجية الفرز: تم حضن خلايا HEK293T مع (LPs) وفرزها باستخدام جهاز BD FACSAria Fusion. اعتمدت استراتيجية البوابة (gating) على خصائص التشتت الأمامي والجانبي (FSC-A, SSC-A) للتمييز بين (LPs) العارية، والخلايا الخالية من (LPs) (LP-)، والخلايا التي تحتوي على (LPs) (LP+). تم ضمان الحيوية من خلال استبعاد الأحداث الموجبة لـ DAPI (الخلايا الميتة). كما تم إجراء تمييز الجسيمات المفردة لاستبعاد التجمعات.
- التحقق والتحليل: تم التحقق من المجتمعات المفرزة باستخدام قياس التدفق الخلوي التصويري. وتم تحليل التفاعل الفيزيائي بين (LPs) والخلايا عبر المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) والمجهر الإلكتروني النافذ (TEM) لتحديد ما إذا كان الامتصاص داخليًا أم مجرد ارتباط سطحي.
- تطبيق هندسة الأنسجة: تم خلط خلايا (LP+) و (LP-) بنسب محددة وزرعها في أطباء ذات اتصال منخفض للغاية لتكوين كرويات متعددة الخلايا. تم مسح هذه الكرويات باستخدام مجهر كونفوكال فائق الطيف للكشف عن إشارات الليزر وحساب أقطار (LPs) بناءً على أطياف الانبعاث.
النتائج الرئيسية
- أداء وانتظام (LPs): أظهر (LP-B) أداء ليزر متفوقًا، حيث أظهر ليزرًا قويًا عند طاقات ضخ منخفضة (4 نانو جول) مقارنة بـ (LP-A)، الذي تطلب طاقات أعلى وأظهر كفاءة ليزر أقل. وكشف قياس التدفق الخلوي أن (LP-B) يتميز بسطوع أعلى وتوزيع حجم أضيق، بينما أظهر (LP-A) تباينًا أوسع في الحجم ومحتوى الوسط المساعد.
- تعديل السطح والامتصاص: أظهرت (LPs) غير المغلفة ارتباطًا متغيرًا؛ حيث ارتبطت (LP-A) بالخلايا أو امتصت داخليًا، بينما أظهرت (LP-B) حدًا أدنى من الارتباط. وقد أدى الطلاء بـ PEI أو الليبوفيكتامين إلى تحسين ارتباط الخلايا بشكل كبير. وأظهرت (LPs) المطلية بـ PEI أقوى تفاعل، حيث تم تحديد موقع (LPs) حصريًا على الخلايا بعد الغسل.
- كفاءة الفرز وحيوية الخلايا: نجح الفرز التجاري في فصل مجتمعات (LP+) و (LP-) و (LPs) العارية. ومع ذلك، لوحظت اختلافات تعتمد على الشركة المصنعة: أظهرت (LP-A) كفاءة امتصاص داخلي أعلى (19.2% من الأحداث كانت LP+) مقارنة بـ (LP-B) (5.1%). وبينما حافظت الخلايا المرتبطة بـ (LP-A) على معدلات تكاثر مماثلة للمجموعات الضابطة، أظهرت الخلايا المرتبطة بـ (LP-B) (سواء فئة LP+ أو LP-) انخفاضًا بنسبة ~20% في التكاثر بعد 5 أيام، مما يشير إلى تأثير تثبيطي محتمل لـ (LP-B) على نمو الخلايا.
- آلية التفاعل: كشفت صور SEM و TEM عن آليات تفاعل متميزة. فقد تم امتصاص (LP-A) بالكامل، حيث غلف غشاء الخلية الجسيم تمامًا ووضعه في اتصال مباشر مع العصارة الخلوية (cytosol). في المقابل، كانت (LP-B) مغلفة جزئيًا فقط، حيث شكلت "كأسًا" غشائيًا حول الجسيم دون اتصال مباشر مع العصارة الخلوية.
- هندسة الكرويات: مكن نهج الفرز من إنتاج كرويات بنسب محددة من الخلايا التي تحتوي على (LPs) والخلايا الخالية منها. تم اكتشاف إشارات الليزر حتى عمق 300 ميكرومتر داخل الكرويات، ويمكن حساب أقطار (LPs) الفردية من أطياف الانبعاث، حتى في الأنسجة عالية الكثافة بصريًا.
الأهمية والادعاءات
يدعي البحث أنه يضع حجر الأساس لدراسات هندسة الأنسجة الأكبر من خلال إثبات أن أنظمة قياس التدفق الخلوي التجارية يمكن تكييفها بفعالية لتنقية وتحليل الخلايا الموسومة بميكروليزرات كبيرة. ويؤكد المؤلفون أن هذا النهج القائم على التشتت يلغي الحاجة إلى أنظمة مائيات دقيقة مخصلة ومعقدة، مما يجعل الوسم البصري عالي الدقة وتتبع الخلايا المفردة أكثر سهولة في الوصول إليها.
علاوة على ذلك، تسلط الدراسة الضوء على أهمية توصيف خصائص (LPs) (الانتظام، السطوع) وكيمياء السطح، حيث تؤثر هذه العوامل بشكل حاسم على أداء الليزر، وآلية امتصاص الخلايا، وحيوية الخلايا. إن القدرة على التحكم الدقيق في كثافة (LPs) داخل الكرويات تفتح آفاقًا جديدة للاستشعار في الأنسجة العميقة والتحقيق المنهجي في التفاعلات بين الخلايا والجسيمات. وأخيرًا، يقترح المؤلفون أن هذا الإطار يوفر نموذجًا قويًا لدراسة التأثير الفسيولوجي للمواد البلاستيكية الدقيقة البيئية على صحة الإنسان، نظرًا للقدرة على تتبع ومراقبة هذه الجسيمات على مستوى الخلية الواحدة.
غارق في أبحاث مجالك؟
تصلك نشرة يومية بأحدث الأبحاث المطابقة لكلماتك البحثية المفتاحية — مع ملخصات تقنية، بلغتك.