Enriching microlaser-labelled cells by commercial flow cytometry-based cell sorting systems

기술 요약: 상용 유세포 분석 기반 세포 분류 시스템을 통한 마이크로레이저 표지 세포의 농축

문제 제기
형광 염료가 도핑된 폴리스티렌 입자(LP)인 위스퍼링 갤러리 모드(WGM) 마이크로레이저는 밝고 스펙트럼이 좁은 방출 특성 덕분에 고해결도 세포 태깅, 단일 세포 추적 및 바이오센싱 분야에서 독특한 이점을 제공한다. 그러나 생의학 및 조직 공학 맥락에 이를 적용하는 데 있어 결정적인 병목 현상이 존재하는데, 바로 세포 집단 내의 LP 수를 재현 가능하게 제어할 수 없다는 점이다. 수천 개의 표지된 세포를 배양 중에 식별할 수는 있지만, 고급 응용 분야를 위해서는 내부화된 LP의 표지 밀도에 관한 기저 세포 집단의 명확한 순도와 조성을 보장하는 것이 필수적이다. 내부화된 LP의 스펙트럼 바코드를 기반으로 세포를 분류하는 기존 방법들은 맞춤형 제작된 미세유체 장치와 복잡한 광학 시스템에 의존하며, 이는 구축, 유지 관리 및 운영이 어려워 전문 코어 시설로의 접근성을 제한한다.

방법론
저자들은 맞춤형 미세유체 기술 없이도 널리 사용되는 상용 유세포 분석 및 세포 분류 시스템을 활용하여 대형 LP를 포함하는 세포 집단을 정제하는 워크플로우를 개발하였다.

• 입자 선택 및 특성 분석: 두 종류의 상용 LP(LP-A 및 LP-B)를 비교하였다. 이들의 레이징 성능, 광루미네선스(PL) 밝기, 크기 분포 및 균일성을 광학 펌핑, 유세포 분석(FSC-A, SSC-A, Red-PL), 그리고 명시야 현미경을 사용하여 특성화하였다.
• 표면 개질: LP와 세포 간의 결합을 강화하기 위해, LP 표면을 폴리에틸렌이민(PEI) 또는 리포펙타민으로 처리하여 표면 전하를 음전하에서 양전하로 역전시킴으로써 음전하를 띠는 세포막과의 상호작용을 촉진하였다.
• 분류 전략: HEK293T 세포를 LP와 함께 배양한 후 BD FACSAria Fusion을 사용하여 분류하였다. 게이팅 전략은 전방 및 측방 산란 특성(FSC-A, SSC-A)에 의존하여 순수 LP, LP가 없는 세포(LP-), 그리고 LP를 포함하는 세포(LP+)를 구별하였다. 생존율은 DAPI 양성 이벤트(사멸 세포)를 제외함으로써 확보하였다. 응집체를 제외하기 위해 싱글렛(singlet) 판별을 수행하였다.
• 검증 및 분석: 분류된 집단은 이미징 유세포 분석법을 통해 검증되었다. LP와 세포 사이의 물리적 상호작용은 주사 전자 현미경(SEM) 및 투과 전자 현미경(TEM)을 통해 분석되어 내부화 여부와 표면 부착 여부를 결정하였다.
• 조직 공학 응용: 분류된 LP+ 세포와 LP- 세포를 정의된 비율로 혼합하여 초저부착 플레이트에 파종함으로써 다세포 구체를 형성하였다. 이 구체들을 하이퍼스펙트럴 공초점 현미경으로 스캔하여 레이징 신호를 감지하고, 방출 스펙트럼을 기반으로 개별 LP의 직경을 계산하였다.

주요 결과

• LP 성능 및 균일성: LP-B는 LP-A에 비해 낮은 펌프 에너지(4 nJ)에서도 견고한 레이징을 보여 우수한 레이징 성능을 나타냈다(LP-A는 더 높은 에너지가 필요했으며 낮은 레이징 효율을 보였다). 유세포 분석 결과, LP-B는 더 높은 밝기와 더 좁은 크기 분포를 보인 반면, LP-A는 크기와 이득 매질 함량에서 더 넓은 불균일성을 보였다.
• 표면 개질 및 섭취: 코팅되지 않은 LP는 가변적인 부착을 보였다(LP-A는 세포에 부착되거나 내부화되었으나, LP-B는 최소한의 부착만을 보임). PEI 또는 리포펙타민으로 코팅하면 세포 결합이 유의미하게 향상되었다. PEI 코팅된 LP는 가장 강력한 상호작용을 보였으며, 세척 후에도 LP가 세포에 국한되어 위치하였다.
• 분류 효율 및 세포 생존율: 상용 분류기는 LP+, LP-, 그리고 순수 LP 집단을 성공적으로 분리하였다. 그러나 제조사에 따른 차이가 관찰되었다. LP-A는 LP-B(5.1%가 LP+)에 비해 더 높은 내부화 효율(19.2%가 LP+)을 보였다. LP-A와 연관된 세포는 대조군과 유사한 증식률을 유지했으나, LP-B와 연관된 세포(LP+ 및 LP- 분획 모두)는 5일 후 약 20%의 컨플루언시(confluency) 감소를 보였으며, 이는 LP-B가 세포 성장에 잠재적인 억제 효과를 가질 수 있음을 시사한다.
• 상호작용 메커니즘: SEM 및 TEM 이미징은 뚜렷한 상호작용 메커니즘을 밝혔다. LP-A는 완전히 내부화되어 세포막이 입자를 완전히 둘러싸고 세포질과 직접 접촉하게 하였다. 반면, LP-B는 부분적으로만 둘러싸여 입자 주변에 막 컵(membrane cup)을 형성할 뿐 세포질과 직접 접촉하지는 않았다.
• 구체 공학: 이 분류 접근법은 LP를 포함하는 세포와 LP가 없는 세포의 정의된 비율을 가진 구체를 생성할 수 있게 하였다. 레이징 신호는 구체 내부 300 µm 깊이까지 감지될 수 있었으며, 광학적으로 밀도가 높은 조직 내에서도 개별 LP의 직경을 계산할 수 있었다.

의의 및 주장
본 논문은 상용 유세포 분석 시스템이 대형 마이크로레이저로 표지된 세포의 정제 및 분석에 효과적으로 적응될 수 있음을 입증함으로써, 더 큰 규모의 조직 공학 연구를 위한 토대를 마련했다고 주장한다. 저자들은 이러한 산란 기반 접근 방식이 복잡한 맞춤형 미세유체 장치의 필요성을 제거하여, 고해결도 광학 태깅 및 단일 세포 추적을 더욱 용이하게 만든다고 단언한다.

또한, 본 연구는 LP의 특성(균일성, 밝기)과 표면 화학을 규명하는 것이 레이징 성능, 세포 섭취 메커니즘 및 세포 생존율에 결정적인 영향을 미친다는 점을 강조한다. 구체 내의 LP 밀도를 정밀하게 제어할 수 있는 능력은 심부 조직 센싱 및 세포-입자 상호작용의 체계적 연구를 위한 새로운 길을 열어준다. 마지막으로, 저자들은 이 프레임워크가 환경 미세 플라스틱이 인체 건강에 미치는 생리학적 영향을 연구하는 데 있어 강력한 모델을 제공한다고 제안하는데, 이는 단일 세포 수준에서 이러한 입자들을 추적하고 모니터링할 수 있는 능력 때문이다.