Enriching microlaser-labelled cells by commercial flow cytometry-based cell sorting systems

技术摘要：利用商用流式细胞术分选系统富集微型激光器标记的细胞

问题陈述
回音壁模式（WGM）微型激光器，通常为掺杂荧光染料的聚苯乙烯颗粒（LPs），由于其明亮且光谱窄的发射特性，在实现高分辨率细胞标记、单细胞追踪和生物传感方面具有独特优势。然而，将其应用于生物医学和组织工程领域存在一个关键瓶颈：无法可靠地控制细胞群体中微型激光器（LP）的数量。虽然可以在培养物中识别出数以千计的标记细胞，但确保底层细胞群体在 LP 标记密度方面具有定义的纯度和组成，对于先进应用至关重要。现有的基于 LP 内部化光谱条形码进行细胞分选的方法依赖于定制的微流控装置和复杂的光学系统，这些系统难以构建、维护和操作，从而限制了其在专业核心设施中的普及。

方法论
作者开发了一种利用广泛可用的商用流式细胞术和细胞分选系统来纯化含有大型 LP 的细胞群的工作流程，而无需定制微流控装置。

• 颗粒选择与表征： 对两种类型的商用 LP（LP-A 和 LP-B）进行了比较。使用光学泵浦、流式细胞术（FSC-A, SSC-A, Red-PL）和明场显微镜对其激光性能、光致发光（PL）亮度、尺寸分布和均匀性进行了表征。
• 表面改性： 为了增强 LP 与细胞的结合，通过聚乙烯亚胺（PEI）或脂质体对 LP 表面进行改性，使其表面电荷从负电荷转变为正电荷，从而促进与带负电荷的细胞膜的相互作用。
• 分选策略： 使用 BD FACSAria Fusion 对孵育了 LPs 的 HEK293T 细胞进行分选。分选策略依赖于前向散射和侧向散射特性（FSC-A, SSC-A）来区分裸露的 LP、不含 LP 的细胞（LP-）以及含 LP 的细胞（LP+）。通过排除 DAPI 阳性事件（死细胞）来确保活力。进行单细胞判别以排除聚集体。
• 验证与分析： 使用成像流式细胞术对分选后的群体进行验证。通过扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）分析 LP 与细胞的物理相互作用，以确定是内部化还是表面附着。
• 组织工程应用： 将分选后的 LP+ 和 LP- 细胞按定义的比例混合，并接种到超低粘附板中以形成多细胞球体。使用高光谱共聚焦显微镜扫描这些球体，以检测激光信号并根据发射光谱计算 LP 直径。

关键结果

• LP 性能与均匀性： LP-B 表现出优异的激光性能，在低泵浦能量（4 nJ）下即可显示出稳健的激光作用，而 LP-A 则需要更高的能量且激光效率较低。流式细胞术显示，LP-B 具有更高的亮度度和更窄的尺寸分布，而 LP-A 则表现出在尺寸和增益介质含量方面具有更广泛的异质性。
• 表面改性与摄取： 未经涂层的 LPs 显示出不稳定的附着；LP-A 被细胞附着或内吞，而 LP-B 显示出极少的附着。使用 PEI 或脂质体进行涂层显著改善了细胞关联性。PEI 涂层的 LPs 显示出最强的相互作用，洗涤后 LPs 仅定位于细胞上。
• 分选效率与细胞活力： 商用分选仪成功分离了 LP+、LP- 和裸露 LP 群体。然而，观察到了依赖于制造商的差异：LP-A 具有更高的内吞效率（19.2% 的事件为 LP+），而 LP-B 则较低（5.1%）。虽然与对照组相比，与 LP-A 结合的细胞保持了相似的增殖率，但与 LP-B 结合的细胞（包括 LP+ 和 LP- 部分）在 5 天后表现出约 20% 的汇合度下降，这表明 LP-B 可能具有抑制细胞生长的潜在效应。
• 相互作用机制： SEM 和 TEM 成像揭示了不同的相互作用机制。LP-A 被完全内吞，细胞膜完全包裹颗粒并使其与细胞质直接接触。相比之下，LP-B 仅被部分包裹，在颗粒周围形成了一个膜杯，但并未与细胞质直接接触。
• 球体工程： 该分选方法能够生成具有定义比例的含 LP 细胞和无 LP 细胞的球体。即使在光学密集的组织中，也可以检测到深达 300 µm 的激光信号，并能从发射光谱中计算出单个 LP 的直径。

意义与主张
本文声称通过证明商用流式细胞术系统可以有效地用于纯化和分析带有大型微型激光器标记的细胞，为更大规模的组织工程研究奠定了基础。作者断言，这种基于散射的方法消除了对复杂、定制化微流控装置的需求，使高分辨率光学标记和单细胞追踪变得更加容易实现。

此外，研究强调了表征 LP 特性（均匀性、亮度）和表面化学的重要性，因为这些因素会关键性地影响激光性能、细胞摄取机制和细胞活力。能够精确控制球体内 LP 的密度，为深层组织传感和系统研究细胞-颗粒相互作用开辟了新途径。最后，作者指出，鉴于能够实现单细胞水平的追踪和监测，该框架为研究环境微塑料对人类健康的生理影响提供了一个稳健的模型。