Enriching microlaser-labelled cells by commercial flow cytometry-based cell sorting systems

Resumen Técnico: Enriquecimiento de Células Marcadas con Microláser mediante Sistemas Comerciales de Citometría de Flujo para la Clasificación Celular

Planteamiento del Problema
Los microláseres de modo de galería de susurros (WGM, por sus siglas en inglés), típicamente partículas de poliestireno (LPs) dopadas con colorante fluorescente, ofrecen ventajas únicas para el marcado celular de alta resolución, el seguimiento de células individuales y la biosensación debido a su emisión brillante y de espectro estrecho. Sin embargo, existe un cuello de botella crítico para aplicar estas herramientas en contextos biomédicos y de ingeniería de tejidos: la incapacidad de controlar de manera reproducible el número de LPs dentro de una población celular. Si bien se pueden identificar miles de células marcadas en cultivo, asegurar una pureza y composición definida de la población celular subyacente con respecto a la densidad de marcado de los LPs es esencial para aplicaciones avanzadas. Los métodos existentes para clasificar células basadas en los códigos de barras espectrales de los LPs internalizados dependen de configuraciones microfluídicas personalizadas y sistemas ópticos complejos, los cuales son difíciles de construir, mantener y operar, lo que limita su accesibilidad a instalaciones centrales especializadas.

Metodología
Los autores desarrollaron un flujo de trabajo utilizando sistemas comerciales de citometría de flujo y clasificación celular ampliamente disponibles para purificar poblaciones celulares que contienen LPs grandes sin necesidad de microfluídica personalizada.

• Selección y Caracterización de Partículas: Se compararon dos tipos de LPs comerciales (LP-A y LP-B). Su rendimiento de las de de ganancia (lasing), fotoluminiscencia (PL), brillo, distribución de tamaño y uniformidad se caracterizaron mediante bombeo óptico, citometría de flujo (FSC-A, SSC-A, Red-PL) y microscopía de campo claro.
• Modificación de Superficie: Para mejorar la asociación LP-célula, las superficies de los LPs se modificaron con poli(etilenimina) (PEI) o lipofectamina para revertir su carga superficial de negativa a positiva, promoviendo la interacción con la membrana celular cargada negativamente.
• Estrategia de Clasificación (Sorting): Se incubaron células HEK293T con LPs y se clasificaron utilizando un BD FACSAria Fusion. La estrategia de selección (gating) se basó en las propiedades de dispersión frontal y lateral (FSC-A, SSC-A) para distinguir entre LPs libres, células sin LPs (LP-) y células con LPs (LP+). La viabilidad se aseguró excluyendo eventos positivos para DAPI (células muertas). La discriminación de singletes se realizó para excluir agregados.
• Validación y Análisis: Las poblaciones clasificadas fueron validadas mediante citometría de flujo de imagen. La interacción física entre los LPs y las células se analizó mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía electrónica de transmisión (TEM) para determinar la internalización frente al acoplamiento superficial.
• Aplicación en Ingeniería de Tejidos: Las células LP+ y LP- clasificadas se mezclaron en proporciones definidas y se sembraron en placas de ultra-baja adhesión para formar esferoides multicelulares. Estos esferoides fueron escaneados con un microscopio confocal hiperespectral para detectar señales de las de ganancia (lasing) y calcular los diámetros de los LPs basándose en el espectro de emisión.

Resultos Clave

• Rendimiento y Uniformidad de los LPs: El LP-B exhibió un rendimiento de las de ganancia superior, mostrando un funcionamiento robusto a bajas energías de bombeo (4 nJ) en comparación con el LP-A, que requería energías más altas y mostraba una menor eficiencia de las de ganancia. La citometría de flujo reveló que el LP-B tenía un mayor brillo y una distribución de tamaño más estrecha, mientras que el LP-A mostró una mayor heterogeneidad en tamaño y contenido del medio de ganancia.
• Modificación de Superficie y Captación: Los LPs sin recubrimiento mostraron una unión variable; el LP-A se unió o fue internalizado por las células, mientras que el LP-B mostró una unión mínima. El recubrimiento con PEI o lipofectamina mejoró significativamente la asociación celular. Los LPs recubiertos con PEI mostraron la interacción más fuerte, localizándose exclusivamente sobre las células tras el lavado.
• Eficiencia de Clasificación y Viabilidad Celular: El clasificador comercial separó con éxito las poblaciones de LP+, LP- y LPs libres. Sin embargo, se observaron diferencias dependientes del fabricante: el LP-A mostró una mayor eficiencia de internalización (19.2% de los eventos fueron LP+) en comparación con el LP-B (5.1%). Mientras que las células asociadas con el LP-A mantuvieron tasas de proliferación similares a los controles, las células asociadas con el LP-B (tanto la fracción LP+ como la LP-) exhibieron una reducción de aproximadamente el 20% en la confluencia tras 5 días, lo que sugiere un posible efecto inhibitorio del LP-B en el crecimiento celular.
• Mecanismo de Interacción: Las imágenes de SEM y TEM revelaron distintos mecanismos de interacción. Los LP-A fueron totalmente internalizados, con la membrana celular envolviendo completamente la partícula y colocándola en contacto directo con el citosol. En contraste, los LP-B solo fueron parcialmente envueltos, formando una copa de membrana alrededor de la partícula sin contacto directo con el citosol.
• Ingeniería de Esferoides: El enfoque de clasificación permitió la generación de esferoides con proporciones definidas de células que contienen LPs y células libres de LPs. Las señales de las de ganancia fueron detectables hasta 300 µm de profundidad dentro de los esferoides, y se pudieron calcular los diámetros de los LPs individuales a partir de los espectros de emisión, incluso en tejidos ópticamente densos.

Significancia y Reivindicaciones
El artículo afirma establecer una base para estudios más amplios de ingeniería de tejidos al demostrar que los sistemas de citometría de flujo comercialmente disponibles pueden adaptarse eficazmente para la purificación y el análisis de células marcadas con microláseres de gran tamaño. Los autores sostienen que este enfoque basado en la dispersión elimina la necesidad de configuraciones microfluídicas complejas y personalizadas, haciendo que el marcado óptico de alta resolución y el seguimiento de células individuales sean más accesibles.

Además, el estudio destaca la importancia de caracterizar las propiedades de los LPs (uniformidad, brillo) y la química de superficie, ya que estos factores influyen críticamente en el rendimiento de las de ganancia, los mecanismos de captación celular y la viabilidad celular. La capacidad de controlar con precisión la densidad de los LPs dentro de los esferoides abre nuevas vías para la detección en tejidos profundos y la investigación sistemática de las interacciones célula-partícula. Finalmente, los autores sugieren que este marco proporciona un modelo robusto para estudiar el impacto fisiológico de los microplásticos ambientales en la salud humana, dada la capacidad de rastrear y monitorear estas partículas a nivel de célula individual.